Validación de Métodos Analíticos: Selectividad, Exactitud, Precisión y Más

1. Selectividad

La selectividad es la capacidad de un método analítico para medir e identificar en forma separada o simultánea los analitos de interés en presencia de otras sustancias químicas que pueden o no estar formando parte de la matriz de la muestra.

1a. Procedimiento:

1. Preparar una solución estándar del analito en estudio según lo indicado en el método de análisis a validar.
2. Preparar un blanco de excipientes contenidos en el producto terminado y tratarlo de la misma forma que a la muestra según el método en estudio.
3. Tanto el estándar como el blanco se determinan en triplicado.

1b. Evaluación:

La selectividad queda demostrada al no existir respuesta con la muestra de excipientes en comparación con el estándar.

2. Exactitud

La exactitud de un método analítico es la cercanía existente entre los valores obtenidos con el método y el valor real. La exactitud debe evaluarse en todo el rango de trabajo.

2a. Procedimiento:

1. Se elabora una mezcla homogénea de los excipientes que contiene el producto sobre el cual se va a aplicar el método. Con esta mezcla se preparan separadamente las muestras, a las cuales se agrega en forma exacta 50, 70, 90, 100, 110 y 130 % del valor declarado del analito en estudio. También es posible agregar dosis volumétricamente, siempre que se utilicen solventes especificados en la monografía.
2. De cada nivel de concentración se deben preparar tres muestras, siguiendo las instrucciones detalladas en el método desde el comienzo de preparación de la muestra.

2b. Evaluación:

La exactitud se evalúa como porcentaje de recuperación del analito en las muestras con respecto a la cantidad teórica agregada. Este parámetro debe encontrarse dentro de un determinado nivel de confianza para aprobar el uso de una determinada técnica analítica.

3. Precisión

Se define como el grado de acuerdo entre los resultados individuales obtenidos con un determinado método. Se expresa generalmente como desviación estándar o desviación estándar relativa (coeficiente de variación).

La precisión puede ser una medida del grado de reproducibilidad o repetibilidad bajo condiciones de operación normales. La repetibilidad es la capacidad del método de generar resultados consistentes al aplicarse por un mismo analista, en un mismo equipo y laboratorio, en un corto período de tiempo. En contraste, la reproducibilidad involucra la capacidad del método de generar resultados consistentes si lo realizan distintos analistas de distintos laboratorios, con equipos diferentes y un mayor período de tiempo.

3a. Procedimiento:

Idéntico al señalado en la sección 2a.

3b. Evaluación:

La precisión se evalúa de acuerdo a la desviación estándar o el coeficiente de variación obtenidos para el grupo de muestras analizadas.

4. Límite de Cuantificación

Es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede determinar cuantitativamente a un grado definido de precisión y exactitud aceptable en las condiciones de trabajo del método. Es posible determinarlo por diferentes medios según el caso:

4a.1. Método basado en el examen visual

Para métodos instrumentales o no instrumentales en los que no se tiene señal numérica, se determina analizando muestras con concentraciones conocidas y decrecientes de analito y estableciendo la mínima concentración en la cual el analito puede ser cuantificado con exactitud y precisión aceptables.

4a.2. Método basado en la relación señal-ruido

Este método requiere que el procedimiento de análisis sea instrumental y que proporcione una señal blanco, un ruido de fondo o una señal base, es decir, una señal residual a concentración cero de analito. Con dicho parámetro, es posible calcular el límite de cuantificación según la siguiente ecuación:

LC = 10 * R * N

LC: límite de cuantificación.

10: factor determinado por test estadístico Style.

N: ruido basal del instrumento.

R: factor de respuesta (se obtiene de la curva de calibración).

4a.3. Método basado en la desviación estándar de la respuesta del blanco y de la pendiente de la recta de calibración

El límite de cuantificación se expresa como:

LC = 10 * ds / m

LC: límite de cuantificación

ds: desviación estándar de la respuesta

m: pendiente de la curva de calibración

La desviación estándar de la respuesta se determina con una curva de calibración especial que contiene muestras del analito en el rango del LC. Pueden usarse para este efecto la desviación estándar residual de una curva de regresión o la desviación estándar del intercepto en el eje Y de la curva de regresión

4b. Evaluación:

Se informa el valor encontrado para el LC y su método de obtención. El LC estimado debe validarse analizando independientemente 5 muestras preparadas con valores en el límite de cuantificación o muy cercanos a él.

En los métodos visuales o el de la relación señal/ruido, es suficiente adjuntar los cromatogramas relevantes como justificación.

5. Límite de Detección

Es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar, aunque no necesariamente cuantificar con una adecuada precisión y exactitud, bajo condiciones experimentales descritas en la metodología analítica. Es posible determinarlo por diferentes medios según el caso:

5a.1. Método basado en el examen visual

En este caso podría determinarse a partir del análisis de muestras con concentraciones conocidas y decrecientes del analito, estableciéndose visualmente la mínima concentración detectable, así como aquella concentración límite que permite cuantificar con razonable precisión y exactitud la señal obtenida. Este procedimiento es el más indicado para métodos de análisis no instrumentales, es decir, en aquellos que no se tiene señal numérica.

5a.2. Método basado en la relación señal-ruido

Este método es uno de los más conocidos y empleados. El procedimiento de análisis debe ser instrumental y proporcionar una señal blanco, un ruido de fondo o una línea base, es decir, una señal residual a concentración cero de analito.

Se establece la señal ruido que proporciona un blanco o placebo (matriz de la muestra conteniendo todos los excipientes a excepción del analito a estudiar). Se recomienda para esto realizar 6 a 10 análisis consecutivos. Una vez establecido este valor, se puede concluir en forma teórica y aproximada que el LD será igual a la concentración del analito que proporciona una señal tres veces superior a este.

LD = 3,3 * R * N

LD: límite de detección.

3,3: factor determinado por el test estadístico Style.

N: ruido basal del instrumento.

R: factor de respuesta (se obtiene de la curva de calibración).

Una vez determinado, se preparan cinco muestras de concentración en el límite de detección y se determinan usando el método en estudio con repeticiones de tres veces cada una.

5a.3. Método basado en la desviación estándar de la respuesta del blanco y la pendiente de la recta de calibración

El límite de cuantificación se expresa como:

LD = 3,3 * ds / m

Donde: LD: límite de detección.

ds: desviación estándar de la respuesta.

m: pendiente de la curva de calibración.

La desviación estándar de la respuesta se determina con una curva de calibración especial que contiene muestras del analito en el rango del LD. Pueden usarse para este efecto la desviación estándar residual de una curva de regresión o la desviación estándar del intercepto en el eje Y de la curva de regresión.

5b. Evaluación:

Se informa el valor encontrado para el LD y su método de obtención. En el caso de usar el método de desviación estándar, el LD estimado debe validarse analizando tres muestras independientemente preparadas que tengan valores en el límite de detección o muy cercanos a él. En los métodos visuales o el de la relación señal/ruido, es suficiente con adjuntar los cromatogramas relevantes como justificación.

6. Linealidad

Capacidad del método de producir respuestas que son proporcionales a las concentraciones del analito en estudio en un rango determinado.

  6a. Procedimiento:

Preparar una curva de calibración de al menos 5 puntos que incluya las siguientes concentraciones analizadas por triplicado:

•   Para valoración, uniformidad de contenido y disolución: 50- 70-90-100-110-130% del valor declarado del analito en estudio.

•   Para disolución retardada: 0-20-40-60-80-100-110% del valor declarado del analito en estudio.

•   Para impurezas: 50-70-90-100-110-120% del valor declarado del analito en estudio,

6b.  Evaluación:

Se utiliza el método de los mínimos cuadrados (regresión lineal) para establecer la curva de calibración. Se determina la existencia de una pendiente significativa y la validez de la curva.

7. Rango   

Intervalo de concentraciones de analito entre los cuales es posible cuantificar con una precisión, exactitud y linealidad adecuada usando el método de interés.

7a. Evaluación:

El rango del método se valida verificando que la técnica otorgue precisión, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que contienen el analito tanto en las concentraciones extremas del rango, así como en cualquier punto intermedio.