Validación de Métodos Analíticos: Parámetros y Procedimientos

1. Selectividad

La selectividad es la capacidad de un método analítico para medir e identificar en forma separada o simultánea los analitos de interés en presencia de otras sustancias químicas que pueden o no estar formando parte de la matriz de la muestra.

1a. Procedimiento

1. Preparar una solución estándar del analito en estudio según lo indicado en el método de análisis a validar.
2. Preparar un blanco de excipientes contenidos en el producto terminado y tratarlo de la misma forma que a la muestra según el método en estudio.
3. Tanto el estándar como el blanco se determinan en triplicado.

1b. Evaluación

La selectividad queda demostrada al no existir respuesta con la muestra de excipientes en comparación con el estándar.

2. Exactitud

La exactitud de un método analítico es la cercanía existente entre los valores obtenidos con el método y el valor real. La exactitud debe evaluarse en todo el rango de trabajo.

2a. Procedimiento

1. Se elabora una mezcla homogénea de los excipientes que contiene el producto sobre el cual se va a aplicar el método. Con esta mezcla se preparan separadamente las muestras, a las cuales se agrega en forma exacta 50, 70, 90, 100, 110 y 130 % del valor declarado del analito en estudio. También es posible agregar dosis volumétricamente, siempre que se utilicen solventes especificados en la monografía.
2. De cada nivel de concentración se deben preparar tres muestras, siguiendo las instrucciones detalladas en el método desde el comienzo de preparación de la muestra.

2b. Evaluación

La exactitud se evalúa como porcentaje de recuperación del analito en las muestras con respecto a la cantidad teórica agregada. Este parámetro debe encontrarse dentro de un determinado nivel de confianza para aprobar el uso de una determinada técnica analítica.

3. Precisión

Se define como el grado de acuerdo entre los resultados individuales obtenidos con un determinado método. Se expresa generalmente como desviación estándar o desviación estándar relativa (coeficiente de variación). La precisión puede ser una medida del grado de reproducibilidad o repetibilidad bajo condiciones de operación normales. La repetibilidad es la capacidad del método de generar resultados consistentes al aplicarse por un mismo analista, en un mismo equipo y laboratorio, en un corto período de tiempo. En contraste, la reproducibilidad involucra la capacidad del método de generar resultados consistentes si lo realizan distintos analistas de distintos laboratorios, con equipos diferentes y un mayor período de tiempo.

4. Límite de cuantificación

Es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede determinar cuantitativamente a un grado definido de precisión y exactitud aceptable en las condiciones de trabajo del método. Es posible determinarlo por diferentes medios según el caso:

LC = 10*R*N

Donde:

• LC: límite de cuantificación.
• 10: factor determinado por test estadístico Style.
• N: ruido basal del instrumento.
• R: factor de respuesta (se obtiene de la curva de calibración).

4a.3. Método basado en la desviación estándar de la respuesta del blanco y de la pendiente de la recta de calibración

El límite de cuantificación se expresa como:

LC = 10*ds/m

Donde:

• LC: límite de cuantificación.
• ds: desviación estándar de la respuesta.
• m: pendiente de la curva de calibración.

La desviación estándar de la respuesta se determina con una curva de calibración especial que contiene muestras del analito en el rango del LC. El LC estimado debe validarse analizando independientemente 5 muestras preparadas con valores en el límite de cuantificación o muy cercanos a él. En los métodos visuales o el de la relación señal/ruido, es suficiente adjuntar los cromatogramas relevantes como justificación.

5. Límite de detección

Es la mínima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar, aunque no necesariamente cuantificar con una adecuada precisión y exactitud, bajo condiciones experimentales descritas en la metodología analítica. En este caso podría determinarse a partir del análisis de muestras con concentraciones conocidas y decrecientes del analito, estableciéndose visualmente la mínima concentración detectable, así como aquella concentración límite que permite cuantificar con razonable precisión y exactitud la señal obtenida.

El límite de detección se evalúa mediante:

LD = 3,3*R*N

Donde:

• LD: límite de detección.
• 3,3: factor determinado por el test estadístico Style.
• N: ruido basal del instrumento.
• R: factor de respuesta (se obtiene de la curva de calibración).

El límite de cuantificación se expresa como:

LD = 3,3*ds/m

Donde:

• LD: límite de detección.
• ds: desviación estándar de la respuesta.
• m: pendiente de la curva de calibración.

6. Linealidad

Capacidad del método de producir respuestas que son proporcionales a las concentraciones del analito en estudio en un rango determinado.

6a. Procedimiento

Preparar una curva de calibración de al menos 5 puntos que incluya las siguientes concentraciones analizadas por triplicado:

• Para valoración, uniformidad de contenido y disolución: 50-70-90-100-110-130% del valor declarado del analito en estudio.
• Para disolución retardada: 0-20-40-60-80-100-110% del valor declarado del analito en estudio.
• Para impurezas: 50-70-90-100-110-120% del valor declarado del analito en estudio.

7. Rango

Intervalo de concentraciones de analito entre los cuales es posible cuantificar con una precisión, exactitud y linealidad adecuada usando el método de interés.

Ejemplo Práctico: Validación de Método para Ibuprofeno

1. Ensayo de Selectividad - Preparación de las muestras y blancos

Pese exactamente 100 mg de Ibuprofeno estándar y llévelos a un matraz aforado de 100 mL. Agregue 20 mL de buffer fosfato pH 7,2 y lleve la solución a un sonicador de baño a 37°C hasta que se disuelva completamente. Posteriormente, lleve a volumen la solución con buffer fosfato pH 7,2; tome una alícuota de 1 mL de esta solución y llévela a un matraz aforado de 50 mL completando a volumen con buffer fosfato pH 7,2 (concentración final de ibuprofeno: 0,02 mg/mL). Lea la solución estándar a 221 nm. Adicionalmente, prepare un blanco de buffer fosfato pH 7,2 y mida tres veces las mismas soluciones de muestra y blanco.

2 a 4. Ensayos de Precisión, Exactitud y Linealidad - Preparación de las muestras y blancos

Se simulará la elaboración de comprimidos de ibuprofeno 100 mg mezclando los determinados excipientes con su principio activo de acuerdo a los siguientes datos referenciales: Composición de una tableta teórica de Ibuprofeno 100 mg (peso total: 142 mg).