Técnicas de Siembra en Medios Sólidos y Líquidos para Microorganismos

Técnicas de Siembra en Medios Sólidos

3.1. Técnicas de Siembra en Medios Sólidos

3.1.1. En Placa

a) Siembra en Profundidad o Homogeneización en Masa

La finalidad principal es el recuento de microorganismos.

Se coloca 1 ml de la muestra en una placa estéril vacía, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan 20-25 ml de medio de cultivo fundido y termostatizado a 45ºC; luego se agita la placa, moviéndola 5 veces en sentido horario, 5 en sentido antihorario, 5 veces de arriba hacia abajo y 5 veces de derecha a izquierda.

La técnica de Barry indica que se debe inocular el medio de cultivo fundido, homogeneizar y después verter en la placa de Petri.

b) Siembra en Superficie o Extensión en Superficie

La finalidad principal es el recuento de microorganismos.

Se colocan 0.1 ml de la dilución de la muestra con pipeta estéril en el centro de la placa con medio de cultivo, y se distribuye con un asa de vidrio acodada (asa de y esteril).

c) Siembra por Agotamiento del Asa o Aislamiento por Agotamiento

La finalidad principal es el aislamiento de microorganismos, aunque también puede ser el recuento, si se emplean asas calibradas o bien se adiciona un volumen conocido mediante pipeta y posteriormente se reparte con el asa.

Se trata de un método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado número de microorganismos, un número reducido de ellos distribuidos individualmente sobre la superficie de la placa. Al incubar esta, cada uno de los microorganismos originará una colonia.

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Siembra en Estría o en Zig-Zag

Se deposita el inóculo en el extremo superior de la placa. Se siembra con el asa, a partir del inóculo, con un movimiento en zig-zag cada vez más amplio (en la línea media de la placa alcanza su máxima amplitud). Para ello, el asa debe contactar suavemente con la superficie del medio, no se debe realizar una presión excesiva, pues se agrietaría. La siembra se efectúa (sin levantar el asa ni flamearla) hasta la zona distal del comienzo, donde se obtendrán colonias aisladas.

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Siembra en Estría Múltiple

Se deposita el inóculo en un extremo de la placa. Con el asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde de la placa. Entre cada tramo se debe flamear el asa. Los segmentos seguidos describen un poliedro regular, el último tramo se efectúa hacia el interior, en el que se obtendrán las colonias aisladas.

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Técnica de los 4 Cuadrantes

Se divide la placa en 4 cuadrantes, se deposita el inóculo en el extremo superior de uno de los cuadrantes (1) y se siembra en estría. Sin flamear el asa, se realiza la misma operación sucesivamente en los otros 3 cuadrantes (2, 3 y 4). En cada uno de ellos se sembrará el inóculo que queda adherido al asa, tras la siembra del anterior. En el último de los cuadrantes sembrado (4), se encuentran las colonias aisladas.

Técnica de los 3 Giros

Se siembra en estría la mitad de la placa.

Flamear el asa. Se gira la placa 90º, sembrando en estría la mitad superior de la misma. Se repite la operación en los puntos 2 y 3.

Las colonias aisladas aparecerán en la zona sembrada en último lugar.

3.1.2. En Tubos

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a) Siembra en Profundidad o Homogeneización en Masa

Es igual a lo visto en placa, pero en tubo.

b) Picadura o Profundidad

En tubos con agar horizontal se siembran introduciendo la punta en el centro del agar. Se toma la muestra con la punta del hilo, se punzona en el centro del medio (contenido en un tubo), introduciendo la punta del hilo hasta 2-3 mm del fondo del tubo. Se extrae el hilo por la misma línea que se introdujo.

c) Superficie Inclinada

En los tubos con agar inclinado, para sembrarlos, se mueve el asa o la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar. Se suele utilizar para obtener masa de microorganismos, renovar cepas (resiembra) y pruebas bioquímicas.

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d) Superficie y Profundidad

En los tubos con agar inclinado, se siembran: se toma la muestra con la punta del hilo, se punzona en el extremo inferior del medio (contenido en un tubo), introduciendo la punta del hilo hasta 2-3 mm del fondo del tubo. Se extrae el hilo por la misma línea que se introdujo. Cuando estamos con el hilo sobre la superficie del medio sólido, se mueve la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar. Se suele utilizar para obtener masa de microorganismos, renovar cepas (resiembra) y pruebas bioquímicas.

Técnicas de Siembra en Medios Líquidos

3.2. Técnicas de Siembra en Medios Líquidos

Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por formación de velo o película, o por sedimento.

Con asa: se sumerge el asa cargada en el medio y se agita, para ello se emplea el vortex.

Con pipeta: se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se homogeneiza.

Con hisopo o escobillón: se realiza de igual modo que con el asa.

Con jeringa: se emplea para inocular en frascos herméticos o a través de tapones de caucho.

Siembra de Anaerobios

3.3. Siembra de Anaerobios

La siembra de anaerobios estrictos puede realizarse en unas condiciones u otras dependiendo de su tolerancia al oxígeno.

Hay bacterias anaerobias extremadamente sensibles al oxígeno molecular y mueren rápidamente por exposición al mismo. Estas deben ser sembradas en las cámaras anaeróbicas (uso corriente en laboratorio de hospitales); que también suelen emplearse como cámara de cultivo.

Si el microorganismo anaerobio tiene una resistencia algo mayor al O₂, se puede realizar la siembra normal, aunque la incubación sea siempre en condiciones anaerobias (p.e. Clostridium y la mayoría de los anaerobios patógenos).

Conservación de Cultivos

4. Conservación de Cultivos

• Cultivos en agar inclinado: se conservan en zonas oscuras a temperatura ambiente o en nevera. Resiembras a intervalos entre 1 mes y 2 años (según la especie).
• Cultivos anaerobios: se mantienen en medios que proporcionan condiciones reductoras. Resiembras cada año.
• Cultivos en tubo: se cubren por completo con parafina líquida estéril. Conservan su viabilidad durante varios años sin hacer resiembras.
• Cultivos liofilizados: el cultivo se congela y deseca mediante alto vacío, se almacena en ampollas de vidrio que se cierran al vacío y se guardan a temperatura ambiente o en nevera. Permanecen viables varios años.
• Método del cultivo continuo: consiste en añadir de forma continua al cultivo, en medio líquido, nutrientes. Simultáneamente se extrae un volumen similar de cultivo.