Técnicas de PCR y Electroforesis: Aplicaciones y Procedimientos

Preparación de Muestras para PCR

La preparación de las muestras para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) requiere ajustar el volumen de la reacción, elaborar la mezcla "madre" y establecer los controles positivo y negativo.

Ajuste del Volumen de Reacción

• Al diseñar una PCR, se debe decidir el volumen final de la mezcla de reacción, que suele ser de 25 o 50 μl.
• Una vez fijado este parámetro, se calculan los volúmenes de cada reactivo a añadir a la mezcla, dependiendo de la concentración final deseada. La diferencia entre la suma de los volúmenes de cada componente y el volumen final se completa con agua milliQ.

Elaboración de la Mezcla Madre (Master Mix)

• Para asegurar una composición homogénea, se prepara una mezcla madre que incluye todos los componentes, excepto el ADN molde.
• La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una reacción por el número de muestras a procesar simultáneamente + 1, incluyendo los controles positivo y negativo.
• Una vez completada la mezcla madre, se reparte la cantidad adecuada a cada tubo de reacción y se añaden los respectivos ADN molde.

Control Positivo y Control Negativo

• Control Positivo: Tubo con mezcla madre al que se añade ADN molde control que contiene el fragmento que se quiere amplificar. Si se observa la banda específica, los reactivos funcionan correctamente.
• Control Negativo o Blanco: Tubo con mezcla madre en el que se sustituye el ADN molde por agua. La calle correspondiente en el gel de electroforesis debe aparecer limpia, sin bandas, para descartar contaminación.

Programación del Termociclador

El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de PCR. Permite programar ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación.

Etapas de la Programación

1. Desnaturalización Inicial: Se calienta la mezcla a 94-95 ºC durante varios minutos para asegurar la completa desnaturalización del ADN.
2. Ciclos de Replicación: Se programan los ciclos de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión. El número de ciclos suele oscilar entre 25 y 35, pudiendo aumentar hasta 40 en casos problemáticos.
3. Extensión Final: Incubación a la temperatura óptima de polimerización de la ADN polimerasa durante 5-10 minutos para asegurar que todos los productos de PCR estén completos.
4. Mantenimiento: Incubación final a 4 ºC sin límite de tiempo para mantener las muestras hasta su retirada, anulando la actividad enzimática y evitando la degradación del producto.

Análisis de los Productos Amplificados

• Se analiza el resultado mediante electroforesis en gel, normalmente agarosa 0,5-2,0%, junto con un marcador de tamaño molecular.
• La presencia de una única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado correctamente.
• La observación de varias bandas indica la presencia de productos de amplificación no deseados, requiriendo repetir la reacción o rediseñar los cebadores.

Electroforesis en gel de agarosa de dos PCR en las que se detectan productos no deseados. En la electroforesis A se observa en todas las muestras una banda inferior a 100 pb (flecha) correspondiente a dímeros de cebadores. En la electroforesis B se observan múltiples bandas inespecíficas de diferentes tamaños en todas las muestras.

Mejora de la PCR Convencional

Para mejorar la PCR estándar, se pueden modificar las condiciones: introducir aditivos en el tampón (glicerol, DMSO), aumentar tiempos de elongación, disminuir tiempos de desnaturalización, variar el pH, ajustar la concentración de iones Mg2+, etc.

Tipos de PCR

PCR Estándar

Es la forma más simple, en la que se amplifica un único fragmento de ADN con un único par de cebadores.

PCR Anidada (Nested-PCR)

Consiste en dos reacciones PCR acopladas, donde la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de la primera. Se usa para aumentar la sensibilidad o la especificidad.

PCR Múltiple

Amplificación de varias secuencias diana simultáneamente en el mismo tubo, empleando varias parejas de cebadores.

PCR con Transcripción Inversa

Permite amplificar y analizar moléculas de ARNm. Se utiliza, por ejemplo, para trabajar con virus de ARN o para diagnóstico clínico.

1. Síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa.
2. Amplificación del ADNc por una ADN polimerasa termoestable.

PCR a Tiempo Real

Permite observar el proceso de amplificación usando reactivos fluorescentes (Ej. SYBR Green) que se intercalan en el ADN, detectando los amplicones ciclo a ciclo.

Ventajas

• El resultado se puede obtener antes de que termine la PCR.
• Mayor sensibilidad que la tinción con bromuro de etidio.
• Menos problemas de contaminación.
• Permite la cuantificación de los amplicones y del ADN diana inicial.

Detección de Amplicones

Se utilizan sondas marcadas con fluorocromos o agentes fluorescentes intercalantes (Ej. SYBR green I) que aumentan su emisión de fluorescencia al intercalarse en el ADN de doble hélice.

Resultados

Se obtienen curvas de amplificación que representan la emisión de fluorescencia en cada ciclo de PCR.

Electroforesis: Fundamento

La electroforesis es una técnica de separación de mezclas complejas basada en la migración de moléculas cargadas a través de una matriz porosa (gel) gracias a la acción de un campo eléctrico.

Principios de la Migración

• La migración depende principalmente del tamaño de los fragmentos de ADN.
• Se utiliza SDS u otros detergentes aniónicos para desnaturalizar el ADN y uniformizar su estructura.
• Se emplean tampones como TBE o TAE para mantener el pH alcalino y la carga negativa del ADN.

Elementos de la Electroforesis

• Cubeta: Contiene el gel y el tampón de electroforesis, con electrodos en sus extremos.
• Soporte Electroforético: Gel de agarosa para la separación de ADN.
• Fuente de Alimentación: Proporciona el campo eléctrico entre el ánodo (polo positivo) y el cátodo (polo negativo).

Interpretación de Resultados

La movilidad electroforética de los fragmentos de ADN es inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño. El carril número 1 suele contener el patrón de ADN, que sirve como referencia de tamaño.

Colorantes

1. Colorantes de Corrida: Permiten visualizar la migración de los fragmentos (Ej. azul de bromofenol).
2. Colorantes Fluorescentes: Bromuro de etidio (BrEt) y SYBR Green, que emiten fluorescencia al intercalarse en el ADN y ser iluminados con luz ultravioleta.