Técnicas de Inmunoensayo: Tipos, Aplicaciones y Principios

Introducción a los Inmunoensayos

Los inmunoensayos son técnicas de laboratorio que aprovechan la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo para detectar y cuantificar analitos de interés en diversas muestras biológicas. Estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos para reconocer y unirse a epítopos específicos en los antígenos, formando complejos inmunes detectables.

Tipos de Inmunoensayos

Ensayos Inmunoenzimáticos (EIA)

EIA Heterogéneos

Un EIA heterogéneo requiere una etapa de separación física del analito libre del unido. Esto se logra típicamente mediante el uso de una fase sólida donde se captura el antígeno o anticuerpo de interés.

EIA Homogéneos

Los EIA homogéneos, por otro lado, no requieren una etapa de separación. Son rápidos, fáciles de realizar y se adaptan fácilmente a la automatización, ya que no requieren pasos de lavado. También pueden detectar analitos de bajo peso molecular.

Ensayos de Inmunofluorescencia

En un ensayo de inmunofluorescencia indirecto, primero se incuba la muestra con el antígeno conocido, luego se agrega un anticuerpo marcado con un fluorocromo que se une al anticuerpo primario de la muestra. Esto amplifica la señal fluorescente y es más sensible que el método directo.

Quimioluminiscencia

La quimioluminiscencia ofrece una excelente sensibilidad, comparable a RIA y EIA. Requiere poca cantidad de reactivos, los cuales son relativamente estables y no tóxicos. Además, los sistemas de detección son simples y de bajo costo.

Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA)

El ELISA es un tipo común de EIA que utiliza una enzima conjugada a un anticuerpo para detectar la presencia de un antígeno o anticuerpo en una muestra.

ELISA Competitivo vs. No Competitivo

En los ensayos ELISA competitivos, el antígeno marcado compite con el antígeno no marcado de la muestra por los sitios de unión a los anticuerpos. La señal es inversamente proporcional a la concentración del analito. En los ensayos ELISA no competitivos, el antígeno se captura primero y luego se detecta con un anticuerpo marcado, siendo la señal directamente proporcional a la cantidad de antígeno.

ELISA de Captura o Tipo Sándwich

El ensayo ELISA de tipo sándwich es adecuado para la detección de antígenos que tienen múltiples epítopos, como anticuerpos, hormonas polipeptídicas, proteínas, marcadores tumorales y microorganismos, especialmente virus.

Western Blot

El Western blot es una técnica que detecta proteínas específicas en una muestra mediante la separación por tamaño y la unión a anticuerpos específicos.

Ventajas del Western Blot

El Western blot permite identificar y proporcionar una cuantificación preliminar de una proteína específica en una mezcla compleja de proteínas. Además, puede determinar el peso molecular aproximado de la proteína de interés.

Desventajas del Western Blot

El Western blot a menudo se utiliza mejor como herramienta confirmatoria que como herramienta totalmente cuantitativa. Puede ser costoso y requiere mucho tiempo, y es más sensible a las impurezas de la preparación de muestras que pueden provocar un alto ruido de fondo.

Aglutinación

La aglutinación es un tipo de inmunoensayo en el que las partículas recubiertas de antígeno o anticuerpo se aglutinan en presencia de un anticuerpo o antígeno complementario, respectivamente.

Aglutinación Directa

• Ocurre cuando los antígenos se encuentran naturalmente en la superficie de las partículas (como los antígenos bacterianos en una prueba).
• Es utilizada principalmente para detectar la presencia de "anticuerpos desconocidos" en el suero del paciente.
• Un ejemplo típico es la prueba de Widal para el diagnóstico de fiebre tifoidea.

Aglutinación Indirecta (o Pasiva)

• Emplea partículas que están recubiertas artificialmente con antígenos que no se encuentran normalmente en sus superficies.
• Se utiliza para detectar "anticuerpos conocidos" en el suero del paciente.
• Se han utilizado para detectar factores reumatoides, anticuerpos antinucleares, anticuerpos contra estreptococos, Trichinella, sífilis, citomegalovirus, entre otros.

Citometría de Flujo

La citometría de flujo es una técnica que mide las propiedades físicas y químicas de las células a medida que pasan a través de un haz de luz.

Componentes del Citómetro de Flujo

Los principales componentes de un citómetro de flujo incluyen el sistema de fluidos, la fuente de luz láser, la óptica y fotodetectores, y un ordenador para el análisis y manejo de datos.

Parámetros FSC y SSC

FSC (dispersión de luz hacia adelante) es un indicador del tamaño celular, mientras que SSC (dispersión de luz lateral) es indicativo de la granularidad o complejidad intracelular.

Aplicaciones Clínicas de la Citometría de Flujo

La citometría de flujo tiene numerosas aplicaciones clínicas, incluyendo:

• Diagnóstico y seguimiento del VIH/SIDA mediante el conteo de células T CD4+.
• Determinación del contenido de ADN o estado de ploidía de células tumorales.
• Monitoreo de pacientes con leucemia o linfoma en busca de "enfermedad residual mínima".
• Detección de células con hemoglobina F.
• Tipificación de antígenos de leucocitos humanos para el trasplante de órganos.

Técnicas de Inmunodifusión

Inmunodifusión Radial (IDR)

El antígeno se difunde en un gel con el anticuerpo uniformemente distribuido, formándose anillos de precipitación proporcionales a la concentración del antígeno.

Inmunodifusión Doble (IDD) o Técnica de Ouchterlony

Tanto el antígeno como el anticuerpo se difunden independientemente a través de un gel, formando líneas de precipitación que permiten comparar los antígenos.

Anticuerpos Policlonales vs. Monoclonales

Anticuerpos Policlonales (pAb)

Ventajas

• Reconocen múltiples epítopos, lo que los hace útiles para técnicas como inmunoprecipitación.
• Pueden tolerar mejor cambios menores en el antígeno.

Desventajas

• Pueden tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados.
• Pueden generar más ruido de fondo en algunas aplicaciones.
• Presentan mayor variabilidad entre lotes.

Anticuerpos Monoclonales (mAb)

Ventajas

• Reconocen un solo epítopo, lo que los hace altamente específicos.
• Son ideales para aplicaciones cuantitativas como citometría de flujo.

Desventajas

• Su producción es más compleja y costosa.

Efecto de Prozona y Postzona

El efecto de prozona ocurre cuando hay un exceso de anticuerpo en relación al antígeno, lo que impide la formación de precipitados. El efecto de postzona ocurre cuando hay un exceso de antígeno en relación al anticuerpo, lo que también dificulta la formación de precipitados. Estos efectos ocurren a los lados de la zona de equivalencia, donde la proporción de anticuerpo y antígeno es óptima para la precipitación.

Turbidimetría vs. Nefelometría

La turbidimetría mide la reducción en la intensidad de la luz que pasa a través de la solución, mientras que la nefelometría mide la luz dispersada a un ángulo específico. La turbidimetría es más sencilla y utiliza un ángulo de detección de 0° o 180°, mientras que la nefelometría utiliza ángulos entre 10° y 90°. La nefelometría es más sensible y permite una cuantificación más precisa, especialmente para la medición de proteínas séricas como inmunoglobulinas.

Factores que Afectan la Calidad de los Resultados en las Pruebas de Aglutinación

• Tiempo de incubación con la fuente del anticuerpo.
• Cantidad y avidez del antígeno conjugado con la partícula portadora.
• Condiciones ambientales del ensayo como pH y concentración de proteína.
• Entrenamiento del personal.
• Apego a las regulaciones de control de calidad.

Causas de Resultados Falsos Positivos en las Pruebas de Aglutinación

• Presencia de anticuerpos no específicos.
• Autoaglutinación de partículas.
• Contaminación de reactivos.
• Variaciones en las condiciones ambientales.

Causas de Resultados Falsos Negativos en las Pruebas de Aglutinación

• Concentración insuficiente de anticuerpos.
• Bloqueo de los sitios de unión de los anticuerpos.
• Anticuerpos débiles.
• Problemas técnicos como inadecuada incubación o lavado.

Láseres en Citometría de Flujo

Los principales tipos de láser utilizados en citometría de flujo incluyen tubos de vidrio rellenos de helio y neón, ytrio-aluminio-granate (YAG), argón y kriptón. La elección de los fluorocromos a utilizar depende de la longitud de onda de la luz láser, ya que cada fluorocromo tiene características espectrales de excitación y emisión diferentes.

Representación y Análisis de Datos en Citometría de Flujo

Los datos se pueden representar en histogramas de un solo parámetro o gráficos de puntos bivariantes. El operador puede establecer "gates" o regiones de interés alrededor de poblaciones celulares específicas para analizar diferentes parámetros intrínsecos y extrínsecos de esas subpoblaciones.

Conclusión

Las técnicas de inmunoensayo son herramientas esenciales en la investigación biomédica y el diagnóstico clínico. La comprensión de los principios, tipos y aplicaciones de estas técnicas es fundamental para la interpretación precisa de los resultados y el avance del conocimiento científico.