Técnicas de Identificación Bacteriana: Pruebas Bioquímicas Esenciales

I. Prueba de Voges-Proskauer y Rojo de Metilo

Estas pruebas se utilizan para diferenciar entre especies bacterianas, especialmente dentro de la familia Enterobacteriaceae. Se basan en la capacidad de las bacterias para fermentar la glucosa y producir diferentes productos finales.

Materiales

• Reactivo de Voges-Proskauer (Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)
• Reactivo de Rojo de Metilo
• Cepas bacterianas: E. coli y Klebsiella
• Medio MR-VP

Procedimiento

1. Por la técnica de inoculación, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y negativo, en el medio MR-VP. Rotular los tubos e incubar durante 48-72 horas a 37°C.
2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18-24 horas.

Interpretación

1. Para la prueba Rojo de Metilo: Añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre, cuyo rango de viraje está entre pH 4.4 (rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo-naranja.
2. Para la prueba de Voges-Proskauer: Agregar al cultivo 0.6 ml (12 gotas) de Alfa naftol y 0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es importante añadir los reactivos en el orden especificado.
   • Prueba positiva: Color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo, observado dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora, los cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva.
   • Prueba negativa: No cambia el color inicial del medio de cultivo.

II. Acción sobre las Proteínas: Producción del Indol

Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias para degradar el aminoácido triptófano.

Principio

Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido triptófano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y amoníaco (NH3). El indol puede detectarse en un medio rico en triptófano, observando la aparición de un color rojo (en forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que contiene p-dimetilaminobenzaldehído.

Materiales

• Cepa indol positivo y negativo.
• Medio líquido peptonado y/o Medio SIM
• Reactivo de Kovac (alcohol amílico + HCL concentrado + p-dimetilaminobenzaldehído).
• Cepas bacterianas: E. coli, Salmonella

Procedimiento e Interpretación

La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo, es indicativo de la presencia de indol y constituye una prueba positiva. Las bacterias que, a pesar de desarrollar en el medio, no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo esta una prueba negativa.

III. Utilización del Citrato como Única Fuente de Carbono

Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como única fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo. Por lo tanto, cualquier medio que se emplee para determinar esta característica no debe contener proteínas ni carbohidratos.

El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.

Principio

La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formación de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons) incluye citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.

Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amonio (NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en hidróxido de amonio (NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado, el azul de bromotimol, cuyo rango de viraje está entre pH 6.9 (verde) y pH 7.8 (azul).

Materiales

• Cepa control citrato positivo y negativo.
• Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado

Procedimiento

1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnica de estría en cada tubo la cepa citrato positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18-24 horas.

Interpretación

• Prueba positiva: Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio inclinado.
• Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.

IV. Hidrólisis de la Urea (Prueba de la Ureasa)

Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que hidroliza la urea, según el siguiente esquema:

(Se necesita el esquema para completar esta sección)