Técnicas de Endurecimiento y Conservación de Tejidos para Microscopía

Inclusión de Muestras

Como regla general, se procede al endurecimiento de la muestra para obtener secciones delgadas. Cuanto más delgada la sección deseada, más consistente debe ser la muestra. La congelación de tejidos previamente fijados permite obtener secciones desde 50 µm hasta nm, utilizando:

• Microtomo de congelación: secciones de decenas de µm.
• Criostato: secciones de 5 a 20 µm.
• Ultracriotomo: secciones ultrafinas del orden de nm.

Para evitar daños por formación de cristales de hielo, se deben considerar:

1. Anticongelantes (crioprotectores) como la sacarosa al 30%, dimetil sulfóxido, glicerol, etilén glicol.
2. Congelación rápida con nitrógeno líquido.
3. Obtención de secciones de grosor variable mediante diferentes métodos de endurecimiento.

Métodos de Endurecimiento

La inclusión es el método más común para endurecer el tejido. Consiste en infiltrar la muestra con sustancias líquidas que se solidifican, preservando las características del tejido.

• Para microscopía óptica: parafina o celoidina.
• Para microscopía electrónica: resinas acrílicas o epoxi.

La mayoría de los medios de inclusión no son hidrosolubles, por lo que se debe eliminar el agua y sustituirla por un líquido miscible.

Deshidratación

Deshidratación: La parafina no es miscible con agua, por lo que se realiza la deshidratación del tejido en alcoholes (normalmente metanol) de gradación creciente hasta 100°. Se sumergen los tejidos en líquidos anhidros para evitar alteraciones por deshidratación brusca. Luego, se transfiere el tejido a una sustancia intermediaria miscible con alcohol 100° y parafina, como benceno, xileno, tolueno u óxido de propileno. Estas sustancias son generalmente aclarantes.

Uso de Parafina

La parafina es una mezcla de hidrocarburos saturados, sólida a temperatura ambiente, con punto de fusión entre 40 y 70 °C. Se utiliza parafina líquida en una estufa a temperatura adecuada. Se realizan tres pasos en parafina para una buena impregnación. El tiempo excesivo en parafina puede endurecer el tejido. Tras el embebimiento, se vierte parafina líquida en un molde, se introduce la muestra y se deja solidificar. Se recortan los bloques y se adhieren a un taco de madera para realizar cortes con el micrótomo.