Siembra en tubo con medio liquido

Sembrar consiste en depositar un inóculo o muestra en un medio de cultivo apropiado para su crecimiento y desarrollo. Para poder llegar a la identificación de una bacteria, es preciso separarla de otras q puedan coexistir con ella. Para ello se efectúan siembras para aislamiento. Se aislarán así los microorg, para obtener después cultivos puros. A partir de estos cultivos puros realizaremos dif pruebas para identificar al microorg. Cuando una bact se desarrolla en un medio de cultivo sólido, da lugar a una colonia de elementos derivados de la misma. X lo tanto podemos definir colonia como conj de microorgs idénticos entre sí xq proceden todos de un solo microorg viable o unidad formadora de colonia.
Resembrar consiste en pasar un microorg de un medio de cultivo a otro.
Inóculoes una cant suficiente y representativa del microorg problema. Es necesario preparar un inóculo de siembra para obtener resultados fiables, cuando las muestras sean muy viscosas o concentradas y para técnicas en las q se pretenda el aislamiento del germen o la realización de un análisis cuantitativo.

TÉCNICA GRAL DE PREPARACIÓN DE INÓCULOS: Se obtienen a partir de un cultivo joven (fase exponencial del crecimiento) y puro, o de una muestra. Técnica:

1. Se toma con el asa estéril varias colonias de un cultivo o una xción de la muestra biológica, y se suspende en unos 5 ml de sol diluyente, tras lo cual se homogeniza. Como diluyente se pueden utilizar: a Caldo de cultivo: se usará un medio base líquido. Normal/ el q se vaya a utilizar después pero sin agar.

b

Solución salina estéril: suele ser lo más adecuado. c Agua destilada estéril: si no disponemos en el momento de ninguno de los 2 anteriores.

2. Tb se puede preparar un inóculo tomando con el asa estéril varias colonias de un cultivo o una xción de la muestra biológica, y sembrándolas x estría en superficie en un tubo q contenga un medio base sólido inclinado.

ESTANDARIZACIÓN DE INÓCULO: TÉCNICA DE KIRBY-BAUER:

Se basa en utilizar un gradiente de turbidez. Cada tubo de la escala va numerado y sirve como patrón de ref, sg [microorg] q se requiera. Cuanta más turbidez más microorg habrá. El inóculo se puede ajustar al patrón de ref de 2 formas:
1- X comparación visual aprox: comparando la turbidez de la muestra con la de los patrones de la escala. Es menos exacta y es útil  sobre todo para operadores con cierta experiencia. 2- X espectrofotometría: haciendo coincidir la absorbancia (la turbidez) del problema con la del patrón reqrido.

Una escala universal/ aceptada es escala de Mc Farland, formada x una serie de tubos en los q se origina un precipitado blanco de sulfato bárico, x reacción de ác sulfúrico con cloruro bárico. 

CONSIDERACIONES GRALES SOBRE SIEMBRA:

- Antes de comenzar la siembra se colocan ordenada/ y a mano todos los medios y utensilios q van a necesitarse sobre una mesa limpia y protegida con papel de filtro. Tb es necesario disponer de recipientes con solución desinfectante para ir depositando el material contaminado.

- Los medios de cultivo q van a inocularse deben estar atemperados y libres de agua de condensación.

- Las placas no deben estar fuera del frigorífico más de 2  horas, para evitar la desecación del medio. 

- Todos los procedimientos de inoculación deben efectuarse en cond de asepsia y con utensilios perfecta/ estériles.

- Trabajar siempre cerca de la llama del mechero para prevenir riesgos.

- Identificar las placas, tubos, xtaobjetos y cualquier recipiente de la muestra para su reconocimiento posterior. Antes se solía emplear un núm de orden, la fecha del día y las iniciales de nombre y apellidos del paciente, hoy se usan los códigos de barras. Las placas se rotulan en la parte inf q contiene el medio, x si la tapadera pudiera cambiarse o extraviarse.

- Flamear el asa, hilo o instrumento utilizado para la siembra, si no es de material desechable, inmediata/ antes y después de su empleo. Evitar introducirlos calientes dentro de la muestra, xq se pueden formar aerosoles q originan contaminación ambiental y xq ocasionaría la destrucción de los microorgs x el intenso calor.

- Evitar el golpeo brusco del asa sobre los medios de cultivo o las paredes de los recipientes, así como la expulsión intensa de los contenidos de pipetas y jeringas, q provocan la formación de aerosoles. Las pipetas para tomar muestras deben estar taponadas con algodón graso y se emplearán dispositivos de pipeteo x razones de seguridad. El inóculo no debe soplarse en los tubos o placas para evitar contaminación.

- Flamear la boca de los recipientes después de abrirlos y antes de cerrarlos, con el fin de crear una atmósfera caliente q prevenga la contaminación; los tapones se toman con el dedo meñiq de la mano derecha y nunca se dejan sobre la mesa.

- Mantener las placas cerca de la llama del mechero siempre q se abran, para asegurar una atmósfera estéril. Igual se procederá con tubos, matraces, frascos, etc.

- Las placas sembradas se incubarán de forma invertida y siempre se mantendrán en esta posición salvo para la técnica del antibiograma x difusión.

INSTRUMENTOS USADOS EN SIEMBRA:

Asa de siembra:

su principal aplicación es la estriación de placas y la siembra en medios líq. Antes se usaban de platino, pero actual/ se usan más las asas de nicron, un material mucho más barato y resistente, o las asas de plástico desechables y calibradas; estas últimas han conquistado el mercado x su comodidad de manejo.

Hilo o aguja de siembra:

se utilizan fund/ para realizar siembras en picadura. Tb han sido reemplazados los de platino x los de nicron o los de material plástico, desechables.

Escobillón o hisopo:

se trata de una varilla de madera, plástico o alambre, q en uno de sus extremos lleva enrollada una xción de algodón. Son muy útiles para efectuar la primera parte de la siembra (descarga) a partir de los prod patológicos, para la transferencia de cultivos líq a placa y de cultivos líq a medios líq y para la siembra masiva.

Varilla, asa o espátula de Driglasky:

se usa para la siembra masiva en superficie. Pueden ser de vidrio o de plástico (desechables).

Pipeta Pasteur:

se utiliza para la inoculación de muestras líq fund/. Hoy día se emplean con preferencia las pipetas estériles de plástico, desechables.

Jeringas:

son adecuadas para la inoculación de las muestras tomadas mediante punción y transxtadas dentro de ellas. Ad se utilizan para subcultivos en placa a partir de frascos de  hemocultivo y para transferir cultivos líq.

TÉCNICAS DE SIEMBRA:

1.- SIEMBRA EN TUBO:

1.A EN MEDIO LÍQ:

Cuando la muestra es líq se toma con el asa previa/ flameada, (o con la jeringa, el hisopo, etc.) lo más vertical posible y se introduce en el medio de cultivo cerca de la superficie, depositando el contenido del asa dentro de éste, moviendo ligera/ el asa. Cuando la muestra es sól se hace igual pero golpeando ligera/ la pared del tubo cerca de la superficie del medio.

Inoculación con asa: Técnica:

- Sujetar ambos tubos con la mano izquierda. El tubo donde está el microorg entre los dedos índice y corazón y el tubo q vamos a inocular entre el corazón y el anular *, usando el dedo pulgar para sujetar ambos tubos. - Mantener los tubos lo más horizontal posible siempre cerca del mechero y con la boca dirigida a la llama. - Con la mano derecha flamear el asa hasta ponerla al rojo en toda su extensión, después se flamea la parte metálica del mango de Kölle y x último se pone otra vez al rojo el asa. - Esperar a q se enfríe manteniéndola en la zona aséptica. - Quitar mientras los tapones de los dos tubos y sujetarlos entre los dedos corazón y anular el del tubo estéril, y entre anular y meñiq el tubo q contiene la muestra, cuidando q no nos rocen ni se rocen entre sí. Si el tapón es de algodón graso, la parte q se sostiene es siempre la q sobresale del tubo, la parte q penetra en el tubo nunca debe tocarse con los dedos, no debe rozarse con la mano ni con el algodón del otro tubo, y x supuesto no debe caerse a la mesa o al suelo, con el objeto de no contaminar el interior del tubo. - Flamear la boca de los tubos a la llama.  - Inclinar los tubos unos 30º, tomar la muestra del tubo más lejano y hacer una descarga del inóculo frotando suave/ el asa contra la pared del tubo más cercano x debajo del menisco formado. - Flamear las bocas del tubo, taparlos y flamear el asa. - Soltar el asa y el tubo q conténía la muestra. - Mover suave/ el tubo q acabamos de sembrar, mediante movimientos de rotación. El tapón nunca debe mojarse. - Llevar a incubación.

• Cuando se trata de microorgs anaerobios hay q procesarlas en cámaras de anaerobiosis. Si no se dispone de ellas, se deben procesar lo más rápida/ posible.

    Además el tubo a inocular se hervirá unos diez minutos a 100ºC, a fin de expulsar el oxígeno disuelto (si el medio lleva un indicador rédox incorxado, se hervirá hasta q desaparezca el color del indicador).  

    Después se enfría al chorro de agua fría hasta 45-50ºC y se añade el inóculo masiva/, tratando de no agitar enérgica/ para evitar la entrada de burbujas de aire.

     Final/ se le añade de 0,5 a 1 cm3 de vaselina líquida o parafina estéril a fin de crear una barrera al medio para evitar la penetración de aire.

Inoculación con pipeta Pasteur o jeringa: Técnica:

- Tomar el problema con una pipeta o jeringa estéril. - Destapar el tubo y flamear la boca del mismo. - Depositar en el interior del tubo el volumen de muestra deseado. - Flamear la boca del tubo y cerrarlo. Homogeneizar su contenido. - Dejar la pipeta o jeringa en el recipiente adecuado.  - Llevar a incubación.

Inoculación con escobillón o hisopo estéril: Técnica:

- Tomar la muestra con el escobillón o hisopo estéril. - Destapar el tubo y flamear la boca del mismo. - Introducir el escobillón en el medio, agitándolo con movimientos de rotación. Tb se puede romper el escobillón x la parte contaminada del extremo superior y se deja el resto dentro del medio. - Flamear la boca del tubo y taparlo. - Si es necesario, depositar el escobillón en el recipiente adecuado o introducirlo en su funda y llevarlo a esterilizar.  - Llevar a incubación.

1.B EN MEDIO SÓLIDO:

Siembra x estría en superficie en agar inclinado: Técnica:

- Flamear el asa (o el hilo) y esperar a q se enfríe. - Tomar el problema con el asa (o el hilo). - Quitar el tapón del tubo con el dedo meñiq de la mano derecha (si se es diestro) y flamear ligera/ la boca del   mismo. - Introducir el asa (o el hilo) y hacer una suspensión del inóculo en el agua de condensación del fondo del tubo; a continuación sembrar en estrías desde abajo hacia arriba con un movimiento en “S” procurando q las estrías qden bastante juntas. - Flamear la boca del tubo y taparlo. - Flamear el asa. - Llevar a incubación.

Si la muestra se encuentra en un tubo, deberán tomarse los dos tubos a la vez y seguir los seis primeros pasos de la técnica de siembra en medio líquido con asa, después continuar con el punto cuarto de esta técnica.

Este tipo de siembra se hace en tubos con agar inclinado o en pico de flauta y se suele utilizar para la obtención de cultivo puro en cantidad suficiente para a partir de él, realizar las pruebas necesarias.

Siembra en profundidad o picadura: Técnica:

- Introducir el hilo de siembra con el inóculo hasta aproximada/ la mitad del medio, x su eje central con un movimiento recto y vertical.  - Retirar el hilo x el mismo sitio, sin hacer desgarros en el medio. - Llevar a incubación.

Este tipo de siembra se hace en tubos con el medio no inclinado y se utiliza sobre todo para microorgs anaerobios o facultativos y para ver la movilidad de los microorgs si el medio es semisólido.  Se emplea el hilo para evitar q el asa desgarre al medio. Otro tipo de cultivo en profundidad consiste en fundir el medio e inocular el microorg como si fuera en medio líquido, rotarlo entre las manos, esperar a q se solidifiq e incubarlo (siembra en masa).

• Si el microorg es anaerobio se sigue un proceso semejante al descrito para la siembra en medio líquido de este tipo de microorg. La única diferencia es q el medio debe enfriarse hasta q esté sólido

     Los medios para anaerobios suelen llevar un indicador redox y un agente reductor como el tioglicolato sódico.

Siembra en profundidad y estría:

Consiste en combinar los dos métodos anteriores. Se debe hacer siempre con hilo para no desgarrar el medio.

Técnica:

Igual q la técnica anterior, sólo q antes de sacar el hilo del tubo donde se ha hecho la picadura, se lleva hasta la zona más profunda del pico de flauta y se hace una estría como en el primer método, teniendo más cuidado xq con el hilo se desgarra más el agar.

Este tipo de siembra se utiliza para microorgs facultativos, para ver la movilidad de los microorgs, para determinadas pruebas bioquímicas y para conservar los microorgs vivos en el laboratorio (en este caso hay q refrigerar).

Siembra en masa: Técnica:

- Fundir el medio e inocular el microorg. - Rotar el tubo entre las manos. - Esperar a q se solidifiq. - Llevar a incubación.

2.- SIEMBRA EN PLACA:

2.A SIEMBRA PARA AISLAMIENTO:

Inoculación x estrías o en zig-zag:

Se realiza este tipo de siembra para obtener colonias perfecta/ aisladas a partir de la muestra o de suspensiones concentradas de microorgs.

• Como ya hemos dicho, cuando se trata de microorgs anaerobios hay q procesar las muestras en cámaras de anaerobiosis. Si no se dispone de ellas, se deben procesar lo más rápida/ posible.

    Para la siembra se pueden usar las placas de Petri normales, pero incubándolas en condiciones anaerobias, o bien usar las placas con tapaderas de Brewer, q están especial/ ideadas para eliminar el oxígeno y permitir al mismo tiempo el cultivo en superficie de colonias anaerobias. Se puede usar agar de Brewer q contiene tioglicolato sódico como agente reductor.

Consiste en diseminar la muestra en la placa hasta agotarla. Donde depositamos la muestra y al principio de la siembra, los microorgs forman colonias q se desarrollan juntas, pero a medida q la extensión continúa, la suspensión o la masa de microorgs contenida en el asa se va agotando y se originan colonias bien separadas, cada una de las cuales procede de un microorg o de una unidad viable.

Esto se consigue siguiendo alguno de estos esqmas:

Técnica de la estría en placa completa:

- Dividir mental/ la placa en dos mitades. - Flamear el asa y mantenerla en la zona aséptica hasta q se enfríe. - Tomar la muestra. - Abrir la placa lo menos posible pero lo suficiente para no rozar los bordes al sembrar. - Colocar el asa con la muestra en el borde más alejado del operador y diseminar el inóculo extendiendo la muestra de borde a borde de la placa, en estrías paralelas muy próximas en dirección al operador. - Cuando se alcance el centro de la placa, levantar el asa del agar y sin sacarla girar la placa unos 180º. - Continuar la extensión diseminando el resto del inóculo en estrías algo más separadas, ahora alejándonos del operador. Esto evita el obstáculo del borde de la placa. - Flamear el asa antes de soltarla.             

Técnica de los cuatro cuadrantes:

- Dividir mental/ la placa en cuatro cuadrantes. - Flamear el asa y mantenerla en la zona aséptica hasta q se enfríe. - Tomar la muestra. - Abrir la placa lo menos posible pero lo suficiente para no rozar los bordes al sembrar. - Colocar el asa con la muestra en el borde más alejado del operador y descargar el asa en el primer cuadrante, realizando estrías. - Levantar el asa del medio y sin sacarla girar la placa 90º - Repetir lo anterior en cada uno de los otros cuatro cuadrantes.

Técnica de la descarga masiva:

- Flamear el asa y mantenerla en la zona aséptica hasta q se enfríe. - Tomar la muestra.

- Levantar la placa cerrada a la altura de la llama del mechero y abrirla a esa altura, lo menos posible pero lo suficiente para no rozar los bordes al sembrar. - Sosteniendo la placa a la altura de la llama, depositar la muestra en el borde de la placa más alejado y sembrar mediante estrías muy juntas, hasta superponerse. - Flamear el asa, rotar la placa (puede hacerse a la altura a la q  tenemos la placa o bajándola sobre la mesa pero, en este caso, cerrándola y abríéndola a la altura del mechero) y tocar con el asa fría la muestra depositada anterior/, arrastrándola hacia otra zona de estrías en ángulo con las primeras y tocando éstas, de forma q la carga de inóculo se haga en la estriación anterior.  Es muy imxtante q esta segunda zona de estrías toq a la primera, ya q de no ser así, al haber esterilizado el asa, no habría aquí crecimiento. - Repetir el proceso siempre flameando el asa y arrastrando la muestra anterior, hasta conseguir 4 ó 5 zonas de estría. En este punto es fundamental q la última estría no toq la primera. - X último, y ya sin esterilizar el asa hacer una última estría peqña, para q no vaya a rozar ninguna de las zonas, para terminar de descargar el asa si hubiese qdado algo de muestra en ella.

Técnica de la descarga en línea:

- Colocar la placa invertida cerca del mechero. - Flamear el asa y mantenerla en la zona aséptica hasta q se enfríe. - Tomar la muestra. Coger la parte de la placa q contiene el medio y ponerla paralela a la llama del mechero. - Descargar el asa haciendo una estría vertical de un extremo a otro de la placa. - Flamear el asa, colocarla en el principio de la estría anterior y hacer una serie de estrías de lado a lado de la placa, pasando x la estría de descarga. - Colocar la placa sobre la tapa q manténíamos en la mesa, cerrándola. - Girar la placa unos 90º. - Flamear el asa y esperar q se enfríe. - Arrastrar la muestra haciendo otra serie de estrías perpendiculares a las ant, con cuidado de no tocar la descarga inicial. - Sin flamear terminar de descargar el asa en la zona libre de estrías. - Cerrar la placa y flamear el asa antes de soltarla.

Hay muchas otras técnicas de siembra x estrías en placa, de forma q cada laboratorio y cada microbiólogo tiene la suya preferida. Tan sólo hemos visto una muestra de ellas.

Siembra en masa o siembra en placa x vertido:

Difiere de la siembra en estría en q el medio está aún líquido aunq no caliente (a unos 45-50ºC) cuando se inocula, de forma q las colonias se desarrollan en todo el medio, no sólo en la superficie. Así se obtiene una mejor distribución de las colonias cuando las placas están bien preparadas.

Para obtener colonias aisladas, ya q normal/ no puede predecirse el número de células viables de una muestra, debe prepararse siempre varias diluciones de la muestra y prepararse varias placas. Las placas q resulten demasiado concentradas o demasiado diluidas deben eliminarse. Para preparar estas placas con distintas concentraciones se puede hacer x el método de dilución, la técnica es la siguiente:

Técnica de dilución:

- Fundir 3 tubos de medio de cultivo, previa/ rotulados con los números 1, 2 y 3, y mantenerlos a baño María a 45-50ºC. - Tomar con el asa, previa/ esterilizada, la muestra y sembrarla  en el tubo nº 1. - Homogeneizar x rotación entre las palmas de las manos y tomar un asa del mismo resembrándola en el tubo de agar nº2, dejando el primer tubo en el baño a 45-50ºC. - Homogeneizar el tubo nº2, tomar un asa y pasarla al tubo nº3. - Dejar los dos tubos en el baño. - Verter el contenido de cada uno de los tres tubos, homogeneizándolos de nuevo, en  tres  placas  estériles  marcadas  respectiva/  con  los  números 1, 2 y 3. Girarlas suave/ para repartir uniforme/ el agar. - Esperar q se solidifiq el medio. - Incubar en estufa a temperatura adecuada durante 24 horas, colocando las placas en posición invertidas. - Elegir las placa donde estén las colonias más aisladas.

Estos métodos de siembra en placa para aislamiento proxcionan cultivos puros a partir de mezcla de microorgs, ya q una vez q las colonias crezcan separadas, se toman con el asa x separado las colonias crecidas en las placas de agar q presenten aspecto diferente, se siembran en tubos con caldo nutritivo o agar común inclinado y se llevan a la estufa para obtener masa de cultivos puros y poder proceder a la identificación y al antibiograma.

2.B SIEMBRA PARA CRECIMIENTO MASIVO:

Siembra masiva en superficie o siembra en placa x extensión:

Consiste en distribuir la muestra x la superficie del medio de cultivo contenido en la placa, de una manera uniforme. Se utiliza para ello la espátula de Driglasky, el escobillón o el asa. Es el método idóneo para el recuento de colonias (utilizando asas calibradas) y para la realización del antibiograma x el método de difusión. En este caso Tb se llama siembra en césped ya q los microorgs deben crecer de forma q cubran total/ la placa pareciendo una alfombra o césped.

Técnica:

- Efectuar la descarga sobre la parte central de la placa.  - Estriar toda la placa. - Girar 90º y volver a estriar toda la placa. - Estriar la placa en las dos diagonales restantes. - Realizar todas las estrías q sean oxtunas, girando una y otra vez la placa para q qde uniforme/ repartida.

CULTIVO DE MICROORG:

Tras la preparación de un inóculo y posterior siembra del mismo o de la muestra problema en el medio de cultivo adecuado, se reqrirán unas condiciones para q lo q hemos sembrado pueda desarrollarse, y poder realizar posterior/ los oxtunos estudios cualitativos o cuantitativos del microorg problema. Para esto se pondrán los tubos y placas inoculados a incubar en una estufa, es lo q llamamos cultivo de una muestra o de un inóculo. Las placas siempre se deben incubar invertidas, pues debido a la elevada concentración de agua en el agar, durante la incubación se forma agua de condensación q resbalaría desde la tapa a la superficie del agar, extendíéndose y provocando una masa de crecimiento confluente, impidiéndose la formación de colonias aisladas. Para q el cultivo sea el correcto se requieren unas condiciones adecuadas:

1.- Temperatura:

La temperatura óptima de incubación para la mayoría de los microorgs, especial/ los patógenos, está próxima a la corxal (35-37ºC), pero existen variaciones. Algunos no pueden soxtar esta temperatura, y otros tienen un margen más amplio. Determinados hongos y levaduras dermatofitos, crecen  mejor a temperatura ambiente, próxima a los 30ºC. Estas temperaturas constantes se consiguen fácil/ gracias a las estufas de cultivo. Es muy imxtante q la T de incubación se mantenga en los límites establecidos durante todo el proceso. Para evitar oscilaciones incontroladas, aparte del termómetro externo q llevan las estufas es aconsejable dotarlas de un termómetro interno q pueda registrar las posibles variaciones.

2.- Tiempo de incubación:

Será de 18-24 horas, en términos generales. Algunas bacterias necesitan una incubación adicional para desarrollarse bien y han de mantener hasta 48-72 horas. A veces será necesario más tiempo, como x ejemplo las q crecen a temperatura  17º (psicrófilas) se mantienen 5 días a 17ºC; 15 días para los hongos dermatofitos. Los microorgs anaerobios se suelen cultivar de 72 a 96 horas y con frecuencia necesitan incubarse durante 7 días antes de dar como negativos los resultados.

3.- Condiciones de esterilidad:

Para evitar el crecimiento de otros microorgs q pudieran interferir cualquier determinación del germen problema es necesario trabajar en condiciones de esterilidad. De ahí q se requieran recipientes cerrados, como tubos con tapones de algodón, tapones de cierre hermético o tapones metálicos no herméticos si requieren de la presencia de oxígeno, placas de Petri, etc.

4.- Concentración adecuada de oxígeno u otros gases:

Si el microorg problema es aerobio, necesitará la cantidad suficiente de oxígeno. Si es anaerobio facultativo puede necesitar según los casos, un ambiente microaerófilo o la cantidad adecuada de CO2, estas condiciones serán variables en cada caso dependiendo del tipo de metabolismo: oxidativo y/o fermentativo del microorg problema. Si la bacteria es anaerobia habrá q crear una atmósfera carente de oxígeno.

En resumen: para mantener todas estas condiciones en los medios de cultivo, de forma q permita un normal y adecuado crecimiento de los microorgs, será imxtante tener en cuenta las siguientes precauciones: - Evitar la apertura de los medios de cultivo, sobre todo en el periodo de incubación. Sólo se abrirán cuando sea estricta/ necesario. - Controlar la temperatura de las estufas. - Verificar las condiciones de oxígeno y/o dióxido de carbono. - Rotular adecuada/ los medios y añadir el día y hora en q se efectuó la siembra.

ESTUFAS DE CULTIVO:

Las hay de varios tipos según el microorg a cultivar:

ESTUFAS CONVENCIONALES: son las más utilizadas, en ellas se incuban medios de cultivo con microorgs aerobios y anaerobios facultativos. Controlan la temperatura y la protección ambiental.

ESTUFAS O INCUBADORAS DE CO2: Además controlan el contenido de CO2. En ellas se incuban microorgs cuyo aislamiento se ve favorecido x la presencia de un 5-10% de CO2, como es el caso de Brucella, Neisseria...

Cuando no se dispone de estufa de CO2, el método más sencillo y más frecuente/ utilizado es el uso del “frasco bujía” q consiste en un recipiente en el q se colocan las placas de Petri junto con una bujía q no produzca humo; se enciende la misma y se cierra la tapa hermética/. La llama arderá hasta q el nivel de oxígeno descienda lo suficiente como para impedir la combustión, al apagarse la bujía, la atmósfera contiene aproximada/ del 3 al 5 % de CO2, incubándose el conjunto en una estufa convencional. Este sistema de la bujía se puede sustituir x un sobre generador de CO2. Tb puede sustituirse el aire x CO2 mediante un sistema de válvulas de tal forma q x una sale aire y, al mismo tiempo, x la otra entra el dióxido de carbono.

SISTEMAS HERMÉTICOS DE INCUBACIÓN DE ANAEROBIOS:

BOLSA ANAERÓBICA: consiste en una bolsa de plástico q cierra hermética/ y dentro se introducen las placas o los tubos y un generador de anaerobiosis. La placa se puede ver en cualquier momento de la incubación sin exponerla al aire.

JARRA DE ANAEROBIOS O JARRA DE GASPAK: es un sistema sencillo para la obtención de una atmósfera anaerobia. Pueden ser metálicas pero con más frecuencia son de plástico transparente para poder ver lo q ocurre en su interior. Tienen una tapadera hermética sujeta con una abrazadera para evitar pérdidas.

Hay de 2 tipos dependiendo de la forma de conseguir la anaerobiosis:

1. Jarras con un sistema de reemplazamiento del aire de su interior x una mezcla de gases: N2 (85%), H2(10%), CO2(5%). En la tapa hay dos válvulas una de entrada y otra de salida y un manómetro q nos marca la presión interior.

2. Jarras q generan en su interior la anaerobiosis mediante una reacción química

Las más utilizadas son las del segundo tipo. Contienen en su interior un sobre q viene preparado comercial/ y q genera anaerobiosis mediante una mezcla química q al contacto con el aire genera H2 y CO2. Así el O2 del aire es reducido a agua, mediante la siguiente reacción: 2 H2 + O2_à 2 H2O

Y x otra parte, el CO2 es empleado x ciertos anaerobios para su crecimiento.

Este sobre se activa mediante el simple agregado de 10 ml de agua. Para q ocurra la reacción anterior, es necesaria la presencia de un catalizador q suele ser gránulos de alúmina recubiertos con paladio. Estos catalizadores se inactivan x exceso de humedad, x lo q debe colocarse en el interior de la jarra una sustancia q absorba la humedad, debiendo cambiarse cada vez q se utilice la jarra. Estas jarras Tb deben contener en su interior indicadores de anaerobiosis. Los hay de tipo bacteriológico y de tipo químico. Los bacteriológicos consisten en introducir en la jarra un cultivo de un aerobio estricto; si éste crece, indica un fallo en el establecimiento de la atmósfera de anaerobiosis. El inconveniente de estos indicadores es q los resultados no son conocidos hasta el final de la incubación. X ello se usan más los indicadores químicos, q son unos indicadores rédox q se decoloran cuando están reducidos. Los más utilizados son las tiras de azul de metileno q son azules cuando están oxidadas y las de resazurina q son rosas. Pueden estar incorxados al medio de cultivo.

CABINA DE ANAEROBIOSIS: es una cámara en cuyo interior se genera la anaerobiosis mediante un catalizador (paladio) e hidrógeno. El material se incorxa y se retira a través de unos guantes de plástico q acceden a su interior. En ella se procesa un gran volumen de muestras de anaerobios.