Replicació de l'ADN i Enginyeria Genètica

Replicació de l'ADN

Kornberg: va aïllar l'ADN polimerasa d'E. coli i va sintetitzar l'ADN in vitro. Necessita una cadena motlle i un fragment (encebador) a partir del qual anirà afegint nucleòtids per l'extrem 3'.

Cairns: va observar que la replicació començava en un punt a partir del qual es formava una forqueta de replicació.

Okazaki: va descobrir uns fragments de 1000 a 2000 nucleòtids que contenien alguns nucleòtids d'ARN; aquests fragments feien créixer la cadena de forma discontínua en l'altra direcció.

Mecanisme de la replicació (cèl·lula procariota)

Velocitat: 500 nucleòtids/seg.

• Helicasa: Trenca els ponts d'hidrogen per separar les dues cadenes d'ADN.
• Topoisomerasa: Trenca i empalma les cadenes d'ADN eliminant les tensions.
• Primasa (ARN pol): Sintetitza un fragment d'ARN (primer) que actua com a encebador.
• ADN polimerasa III: Allarga la nova cadena 5'→3'. A la cadena antiparal·lela d'ADN, la polimerasa III sintetitza, després del primer, un fragment d'ADN de mil a dos mil nucleòtids.
• ADN polimerasa I: Retira el primer fragment d'ADN i omple el buit amb nucleòtids d'ADN.
• ADN ligasa: Uneix els fragments d'Okazaki.

Diferències en la cèl·lula eucariota

És un procés més lent i complicat, l'ADN està associat a histones i té una longitud molt més gran. Va a 50 nucleòtids/seg. Té 100 orígens de replicació. Els fragments d'Okazaki són 10 vegades més petits.

Sistema de reparació

Durant la replicació, el mateix ADN polimerasa III va revisant els nucleòtids. Si es detecten errors, són substituïts pels correctes. Tot i així, encara hi ha algun error cada 10⁷/10⁹ nucleòtids.

Expressió del material genètic

Garrod: Va estudiar una malaltia hereditària anomenada alcaptonúria i va descobrir que era deguda a la falta d'un enzim. Fenilalanina → Tirosina → Àcid homogentísic → X → Àcid maleilacetoacètic. Els que tenien alcaptonúria els hi faltava l'últim enzim, i s'acumulava l'àcid homogentísic, que provocava artritis. És el primer que relaciona els gens amb les proteïnes.

Beadle i Tatum: Van estudiar mutacions provocades per raigs X al moho del pa. Les mutacions afecten els gens que determinen els enzims i provocaven la interrupció de la via metabòlica.

Transcripció

Síntesi d'ARN a partir d'una cadena d'ADN.

ADN → transcripció → ARNm → traducció → proteïna

Iniciació

L'ARN polimerasa s'associa amb el factor σ (sigma) i es forma l'holoenzim. Llavors, aquest reconeix el promotor, les cadenes de l'ADN es separen i surt el factor σ.

Elongació

L'ARN polimerasa afegeix nucleòtids en direcció 5'→3' segons les bases complementàries.

Finalització

L'ARN polimerasa detecta una seqüència de finalització i se separa de l'ADN.

En els procariotes, l'ARN format ja es pot traduir directament. En canvi, en eucariotes, la transcripció i la traducció tenen lloc en temps i compartiments cel·lulars diferents. Aquest ARN transcrit primari ha d'experimentar una sèrie de modificacions (maduració en eucariotes): al transcrit primari se li incorpora un casquet i s'afegeix una cua de moltes adenines a l'extrem 3' com a protecció per sortir del nucli. En el transcrit primari s'han d'eliminar unes seqüències sense sentit que s'anomenen introns mitjançant nucleases. L'ARN ligasa uneix els trossos que seran traduïts i que s'anomenaran exons.

Traducció

Síntesi de proteïnes a partir de la seqüència de nucleòtids de l'ARNm, es llegeix en direcció 5'→3'.

Síntesi de proteïnes

1. L'ARNm s'uneix a la subunitat petita del ribosoma.
2. L'ARNt s'uneix per l'anticodó al codó de l'ARNm. El primer codó que es tradueix és AUG, que correspon a l'aminoàcid metionina.
3. S'uneix la subunitat gran del ribosoma. El complex ribosòmic presenta un centre peptidil (P) i un aminoacil (A).
4. S'uneix un altre ARNt en el centre A.
5. El primer aminoàcid s'uneix al segon mitjançant un enllaç peptídic, i l'altre ARNt sense aminoàcid surt.
6. El ribosoma corre un codó en direcció 5'→3', i l'ARNt queda en el lloc P.
7. Es produeix quan s'arriba a un triplet que no té sentit, allà s'acaba la proteïna. S'allibera la cadena polipeptídica. Finalment, se separa l'ARNm i les dues subunitats del ribosoma.

A mesura que es va formant, la cadena es va plegant i adopta l'estructura terciària.

Codi genètic: És l'equivalència que hi ha entre els nucleòtids de l'ARNm i la seqüència d'aminoàcids de les proteïnes.

Regulació genètica

Els gens no es transcriuen sinó segons les necessitats de les cèl·lules.

• Gens estructurals: Codifiquen proteïnes estructurals i enzims.
• Gens reguladors: Codifiquen proteïnes que regulen els gens estructurals.

Tipus:

• Repressors: S'uneixen a una zona de l'ADN anomenada operador impedint que l'ARN polimerasa iniciï la transcripció dels gens estructurals. Un inductor s'uneix al repressor i la transcripció no queda bloquejada. Un correpressor s'uneix al repressor perquè aquest sigui funcional i atura la transcripció.
• Activadors: S'uneixen al promotor i augmenten l'eficàcia de la transcripció.

A les cèl·lules eucariotes, el control gènic és molt més complex, ja que les cèl·lules estan més diferenciades, presenten ADN no funcional i repetitiu, i hi intervenen hormones.

Les Mutacions

Hugo de Vries: Una mutació és un canvi inesperat en el material genètic. Aquests canvis es produeixen per errors en la replicació o en males reparticions dels cromosomes durant la divisió cel·lular. Els canvis es produeixen a l'atzar. Generalment, els canvis són perjudicials, però són la base de la variabilitat que ha permès a les espècies la selecció natural. Les mutacions poden ser espontànies o induïdes per agents mutàgens (radiacions o substàncies químiques).

Tipus de mutacions

• Gèniques: Afecten un o més parells de bases (substitució 20%, addició o deleció 80%). A les addicions i a les delecions es produeix un corriment en la lectura i s'alteren tots els aminoàcids a partir d'aquella mutació.
• Cromosòmiques: Afecten l'estructura o el nombre de cromosomes.

1. Estructurals: Afecten l'estructura i es poden detectar en l'aparellament dels cromosomes en la meiosi. Tipus:
   • Deleció: Pèrdua d'un fragment de cromosoma.
   • Duplicació: Repetició d'un fragment de cromosoma.
   • Inversió: Un fragment de cromosoma canvia de sentit.
   • Translocació: Intercanvi de fragments entre cromosomes no homòlegs.
2. Genòmiques: Afecta el nombre de cromosomes. Tipus:
   • Fusió cèntrica: Reducció d'un cromosoma per la fusió de dos.
   • Fissió cèntrica: Aparició d'un nou cromosoma perquè s'ha trencat un.
   • Aneuploïdia: Manca o excés de cromosomes a causa d'una mala separació durant la meiosi.
   • Euploïdia: Alteracions de tota la dotació cromosòmica.

Enginyeria genètica

Stanley i Herbert: Van realitzar les primeres experiències que permetien la recombinació de l'ADN. És el conjunt de tècniques encaminades a la manipulació de gens i que permeten introduir gens d'un individu en un altre, tot i pertànyer a espècies diferents. Possibiliten modificar les característiques hereditàries d'un organisme en un sentit prèviament predeterminat.

Procediment

Inserir fragments d'ADN, corresponent a un gen determinat que ens interessi clonar, en un vector (plasmidi bacterià o virus), per a després inserir-lo en la cèl·lula hoste corresponent. L'ADN resultant rep el nom d'ADN recombinant i l'organisme que conté aquest tipus d'ADN, organisme transgènic. En primer lloc, el gen o fragment d'ADN que interessa ha de ser identificat. Aquesta acció la porten a terme els anomenats enzims de restricció, que són capaços de reconèixer seqüències específiques d'ADN fins a 8 i tallar la cadena de forma precisa. Actuen com a tisores moleculars. Com que els enzims de restricció reconeixen una seqüència concreta de nucleòtids, faran el mateix en l'ADN on es vulgui inserir el gen que ens interessa clonar i deixaran, en ambdós casos, els extrems cohesius complementaris. La unió de fragments d'ADN es fa possible gràcies als ADN-ligases, enzims que actuen com a cola.

Aplicacions

• Producció de fàrmacs
• Teràpia gènica
• Millora de producció agrícola i animal
• Eliminació de substàncies contaminants i el tractament de residus

La clonació

• Reproductiva: Consisteix a crear còpies idèntiques d'un organisme ja desenvolupat, de forma asexual.
• Terapèutica: Va dirigida sobretot a aconseguir teixits a partir de cèl·lules mare per al seu trasplantament en persones adultes.