Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Principios, Optimización y Aplicaciones

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Kary Mullis dio a conocer esta técnica en abril de 1983.

Concepto

Es un método sencillo para amplificar fragmentos de ácidos nucleicos.

Etapas de la PCR

• Desnaturalización: Incubar a temperatura alta (93 – 97º C).
• Anelación o Hibridación: Con dos primers o partidores complementarios a secuencias determinadas del ADN blanco que se desea amplificar (50 – 65º C).
• Extensión o polimerización: Del cebador por actuación de la ADN polimerasa (5’ → 3’) a 72 º C. (Taq-polimerasa, Thermus aquaticus).

Optimización de la PCR

• Lograr una buena amplificación requiere optimizar las concentraciones individuales de cada componente de la reacción y los parámetros de tiempo sobre temperatura.

Componentes de la Reacción

• Muestra de ADN / ADN molde / templado
• Iniciadores / Primers / Partidores / Cebadores
• ADN Polimerasa
• Desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs)
• Buffer o amortiguador de la reacción o Tampón PCR
• Sales, proveen iones (KCl y MgCl₂)

Muestra de ADN o ARN (mono o bicatenarios)

• Conocer el origen de la muestra y el proceso de extracción (el uso de EDTA-Fe reduce la concentración de iones Mg++).
• Libre de proteínas (precipitan por calor).
• Libre de fenol, detergentes y factores sanguíneos.
• Cantidad de muestra: Mínimo de 10 a 100 ng. Máximo entre 400 – 500 ng.

Desoxinucleósidos-trifosfato (dNTPs)

• Concentración inicial de cada dNTP entre 50 y 200 µM. 4 - 6 mM pueden inhibir la enzima Taq hasta en un 20 – 30% de actividad.
• Concentración de ión magnesio debe ser 0.5 – 1.0 mM.
• Superior a la concentración de los 4 dNTPs juntos (dCTP, dATP, dTTP, dGTP).
• Pueden usarse dNTP marcadores: biotin-11-dUTP, 7-deasa-dGTP.

Tampón PCR

• Cloruro potásico, gelatina, tampón tris clorhídrico a pH 8.4, cloruro magnésico.
• Cl₂Mg varía entre 0.5 nM y 4 mM; específico para cada sistema. Debajo de 0.5 nM no se obtiene producto de amplificación, por encima de 4 mM se promueve la aparición de un producto no específico.

Primers

• Oligonucleótidos de no más de 30 bases; ideal entre 12 - 25 bases.
• Definen los extremos 5’ del fragmento amplificado. La PCR puede amplificar varias KB, pero se recomienda que sea lo más reducido posible.
• Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de iniciadores, especialmente en sus extremos 3’, esto origina dímeros de primers (primers secundarios).
• El contenido de G + C, cercano al 50%; La relación máxima purina/pirimidina será 60% / 40%.
• Los extremos de las últimas bases deben ser G o C.
• Su purificación debe llevarse a una concentración adecuada (entre 0.1 - 1.0 µM).

Taq-ADN-Polimerasa

• Tiene un peso de 94 KDa.
• Temperatura óptima de acción 75 - 80 ºC.
• Vida Media:
  • 6 minutos a 97.5 ºC.

40 minutos a 95 ºC.

130 minutos a 92.5 ºC.

• Actividad específica: 200,000 unidades/mg con una velocidad de extensión de:

150 nucleótidos/seg/mol de enzima a temperatura óptima.

24 nucleótidos/seg/mol de enzima a 55 ºC.

0.2 nucleótidos/seg/mol de enzima a 22 ºC.

Otras Polimerasas

• T4 ADN polimerasa (E. coli).
• ADN polimerasa dependiente de ARN (retrovirus).
• Pfu polimerasa de Pyrococcus furiosus.
• Tli polimerasa de Thermococcus litoralis (ventana de ventilación de submarino).
• Pfx; Pwo: Pyrococcus woesei; Tth.

Ventajas de la PCR

• Alta sensibilidad: detección de mutaciones y de agentes patógenos.
• Alta especificidad: diagnóstico pre-implantacional (in vitro) y prenatal.
• Permite trabajar con material de archivo: secuenciación de ADN fósiles.
• No requiere utilizar isótopos radioactivos: identificación de especies y control de cruzas entre animales.

Variaciones de la Técnica Básica

• Variaciones de la Técnica Básica
• PCR Múltiple
• PCR Arbitraria
• PCR Asimétrica
• PCR In Situ
• PCR Interna
• PCR Inversa
• PCR en Tiempo Real

PCR en Tiempo Real

• PCR EN TIEMPO REAL : -  Su principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original.
• Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y técnicas que usan sondas específicas.
• En las técnicas basadas en fluorocromos, el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo se une al fluo rocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para Real Time PCR. Permite cuantificar sólo una secuen cia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar primers normales para su realización. Es mucho mas económica que la realización de Realtime PCR con sondas específicas

• Usos de la PCR
• Huella genética
• Test de Paternidad
• Diagnóstico de enfermedades hereditarias
• Clonación de genes
• Mutagénesis
• Análisis de ADN fósil
• Genotipado de mutaciones específicas
• Identificación de especies

TECNICA SOUTHERNBLOT

Cómo se identifican los genes a estudiar?

• Mediante la técnica de los borrones que puede orientarse a rastrear genes sea en la forma de ADN, ARN o sus productos: las proteínas. Consiste en una electroforesis seguida de transferencia y emplean se cuencias específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los princi- pios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más precauciones.

• Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia de determinadas secuencias.
• Hibridación

Se refiere a uno de los tipos más comunes de técnicas usadas por los genetistas y los biólogos moleculares para estudiar el ADN y el ARN aprovechando las características de la doble hélice del ADN, en donde cadenas complementarias de ADN se aparean para constituir la doble hélice. Así, empleando fragmentos de ADN o sondas de cadena sencilla marcada con una molécula trazadora, los investigadores podemos hacer experimentos en el laboratorio que nos permiten identificar el par complementario de la sonda en una mezcla complejade material genético