qPCR: Fundamentos y Aplicaciones en la Expresión Génica

¿Qué es una qRT-PCR y qué ventajas tiene sobre la RT-PCR convencional?

La qRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa) es una técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se utiliza para amplificar y, al mismo tiempo, cuantificar moléculas de ADN o ADN complementario (ADNc) específicas. Esto permite acceder a datos fiables y precisos sobre la expresión genética de las células en estudio.

La PCR en tiempo real puede generar amplicones muy pequeños (desde 60 pb), lo que la hace ideal para la detección de cambios cuantitativos en la expresión génica durante el curso de alteraciones celulares patológicas o experimentales, así como para la cuantificación de niveles de ARNm.

En esta prueba, el producto de la PCR se mide al final de cada ciclo. Los datos pueden ser analizados mediante un software informático, y el número de copias de ARNm o la expresión génica relativa entre varias muestras pueden calcularse.

Las ventajas de la qRT-PCR sobre la RT-PCR convencional son que la cantidad de muestra que se puede analizar es pequeña (60 pb), además de tener la ventaja de una cuantificación para RNA. También muestra la capacidad de monitorear el progreso de la reacción de PCR a medida que esta ocurre, se obtienen datos cuantitativos y tiene alta sensibilidad.

Gráfica de Amplificación de RT-PCR en Tiempo Real

El resultado de una PCR en tiempo real se visualiza en un gráfico de amplificación. En él se expresa la fluorescencia leída por el termociclador en el eje de las ordenadas y el número de ciclos de la PCR en el eje de las abscisas. De esta forma, la curva de amplificación consta de:

• Una fase inicial donde la producción de fluorescencia (ADN producto) está por debajo del nivel de detección del termociclador.
• Una segunda fase en la que se da un incremento de la fluorescencia, el cual es en forma exponencial en su inicio.
• Una tercera fase (plateau) donde finaliza la reacción y se estabiliza la fluorescencia.

En este gráfico es posible establecer un valor de fluorescencia umbral que señala la zona de aumento exponencial. Este valor se representa en el gráfico con una recta horizontal (línea Threshold o Umbral).

¿Qué es un valor Ct y qué lo determina?

El punto de intersección de una curva de amplificación con el umbral se denomina Ct (Threshold Cycle). Este punto indica el ciclo en el que la fluorescencia alcanza el valor umbral. Cuanto más ADN inicial tenga la muestra, antes se alcanza este valor, pues será menor el número de ciclos necesarios (Ct menor) para ello. Si la eficiencia de la reacción es óptima, cada vez que se diluye una muestra 10 veces, el valor de Ct aumenta aproximadamente 3,3 ciclos.

¿Cómo se mide la cantidad de DNA generado en una reacción de qPCR?

Los resultados de la PCR en tiempo real se basan en la detección y cuantificación de los marcadores fluorescentes a lo largo de la reacción de la PCR. Esto permite conocer la cantidad de fluorescencia emitida durante la fase exponencial de la reacción, donde un aumento significativo del producto de la PCR se correlaciona con la cantidad inicial de ADN o ADNc en estudio.

Cuantificación Absoluta

Relaciona la señal obtenida con la PCR en tiempo real al número de copias fijo de una secuencia estándar utilizando una curva de calibración. Las curvas de calibración son altamente reproducibles y permiten la generación de datos específicos y sensibles.

Cuantificación Relativa

No requiere estándares de concentraciones determinadas. Esta técnica se utiliza para obtener la magnitud de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión genética de un gen en estudio en comparación con uno o más genes de referencia. Los cálculos en la cuantificación relativa de expresión genética se basan en la comparación de los valores CT utilizando la eficiencia de la reacción de la PCR como factor de corrección.