Proteïnes: Estructura, Funcions i Determinació

Les proteïnes

Les proteïnes són els principis immediats més abundants en l'organisme. Composats per C, H, O, N, P i S. Formats per aminoàcids un grup amí, un grup carboxil un àtom d'hidrogen i una cadena lateral que és el que diferencia entre sí els diferents aa's. Hi ha 20 aa's diferents, 9 essencials i 11 no essencials. Quan els pèptids tenen -2-10 aa's s'anomenen oligopèptid -11-100 polipèptid -+100 aa's els anomenem proteïnes Procés de formació de proteïnes -Transcripció, l'ADN està format per una doble cadena de desoxiribonucleòtids A-T- C-G. El procés de transcripció es dóna en el nucli de qualsevol cèl·lula eucariota i consisteix a crear una cadena senzilla de RNA (A-U-C-G) complementària a la seqüència d'ADN. -La traducció. El mRNA passa entre les dues subunitats ribosomals a on és 'llegeix' la seqüència per codons formats per 3 bases. Dins del ribosoma, els tRNA complementaris als codó (anticodó) porten un aa unit específic per la seqüència de l'anticodó, que s'uneix per enllaç peptídic a l'últim aa afegit a la cadena polipeptídica El codi genètic és: universal, específic i degenerat Estructura proteïnes 1)Estructura primària Importa quins i a on es la seqüència dels aa's 2)Estructura secundària és la disposició que té en l'espai. Cada enllaç peptídic té un determinat angle de rotació. Dóna lloc a diferents estructures: hèlix-α i làmina-β són les dues més abundants. Pot haver-hi altres 3)Estructura terciària, plegament de la estructura secundària sobre ella mateixa. Part hidròfila a l'exterior. Presència d'enllaços forts com els ponts disulfur i molts de febles. És la que dóna la funció a la proteïna. Es formen diferents zones amb funcions diferents o dominis. 4)Estructura quaternària, unió de dos o més proteïnes per enllaços febles. Algunes proteïnes són funcionals només quan les diferents sub-unitats estan unides (Hemoglobina, Immunoglobulines...)

Funcions de les proteïnes -Transport de molècules o altres -Regulació (hormona proteïna) o segon missatger (resposta a hormona lipídica) -Catàlisi de reaccions -Estructurals -Immunitària -Reserva -Manteniment equilibri osmòtic-Amortidors de pH -Coagulació sanguínia-Energètica -Contracció per generar moviment

Proteïnes plasmàtiques

Les proteïnes plasmàtiques són aquelles que trobem en el plasma i que hi desenvolupen la seva funció en aquest medi. Tenen una concentració aproximada de 7g/dL, l'albumina representa més del 50% d'elles. La majoria són produïdes en el fetge

Completa la següent taula:

Determinació proteïnes plasmàtiques

Es poden mesurar les proteïnes per mètodes electroforètics, químics o immunològics

Un dels mètodes més utilitzats és l'electroforesi que permet obtenir un patró electroforètic de les proteïnes plasmàtiques

•L'albumina és el 50-60% de les proteïnes plasmàtiques

•Les α globulines representen un 14-15% del total de proteïnes plasmàtiques. Augmenten en inflamacions, traumatismes, problemes hepàtics i processos cancerosos

•Les α1 com: α antitripsina, α lipoproteïnes (HDL) que transporten colesterol i vitamines liposolubles, transcobalamina i protrombina (2-5%)

•α2 com la ceruloplasmina, haptoglobina, α2 lipoproteïnes (LDL), EPO, α fetoproteïna (9-14%)

•β globulines, 12-14% de les proteïnes totals. En són exemples la transferrina, C3 i C4, hemopexina. Són força estables i no solen alterar-se

Determinació proteïnes plasmàtiques

•Gamma globulines, representen el 17% del total. Inclou les Ig A, Ig G, Ig M, Ig D i Ig E. També formen part d'aquest grup la PCR i altres proteïnes del complement. Tenen mobilitat electroforètica variada i representen una banda força ampla. Un augment policlonal es degut a processos infecciosos o autoimmunes, i una disminució a immunodeficiències o problemes renals

•Si l'electroforesi es realitza sobre mostra de plasma, apareix una banda nova entre la beta i gamma, corresponent al fibrinogen

El procés electroforètic es realitza en acetat de cel·lulosa, gel d'agarosa o electroforesi capil·lar que es llegit per un fotòmetre que quantifica el colorant fixat a cada franja i el representa en un densitograma

Dins de cada franja hi ha proteïnes amb la mateixa mobilitat però amb característiques molt diferents, que si es volen quantificar s'haurà de fer per mètodes immunològics

Les proteïnes es poden comportar com àcids o com a bases, captant o cedint H+. En funció del pH de la solució els aa's i per tant la proteïna te càrrega positiva o negativa.

El pH en que la molècula te càrrega neutre, mateix nombre de càrregues + que càrregues -, s'anomena punt isoelèctric pI

La solució de treball per fer un patró electroforètic de proteïnes té un pH de 8,6, de manera que totes les proteïnes migren en el mateix sentit. En solucions bàsiques tots els aa's tenen càrrega negativa, de manera que migraran cap a l'ànode.

Per a la determinació de proteïnes especials s'utilitza el mètode de transferència de Western Blot

Mètodes químics hi ha diferents mètodes per la quantificació de proteïnes totals.

La mostra de preferència és el sèrum (tap vermell-tub de BQ). L'estabilitat de proteïnes és alta, una setmana a temperatura ambient, un mes a 4oC i dos mesos a -20oC

• El mètode turbidimètric permet la quantificació de proteïnes totals a 450-620 nm, és poc específic i s'utilitza sobretot en mostres d'orina
• Mètode de Biuret, mètode de referència i més utilitzat. Es prepara una solució alcalina (KOH) amb sulfat cúpric, el Cu+2 reacciona amb l'enllaç peptídic donant un compost lila. Es quantifica a 540nm.

Proteína + Cu+2Cu-Proteïna

• Mètode de Lowry, determinació de l’absorbància a 750 nm. Es basa en la reacció inicial de Biuret que uneix coure a l’enllaç peptídic i provoca desdoblament de la proteïna deixant al “descobert” els residus fenòlics de la tirosina i triptòfan. Aquests en medi bàsic, redueixen el reactiu de Folin. Tècnica molt sensible, però poc específica

Absorbància a 270nm originada principalment pels anells aromàtics del triptòfan i tirosina

Mètodes d’unió a colorants, com el mètode de Bradford que es basa en l'afinitat pels radicals NH3+  del blau de Coomasie

Mètode del verd de bromocresol, per la determinació quantitativa d'albúmina en medi àcid

Els mètodes espectromètrics requereixen una recta de calibratge que normalment es realitza amb BSA (albúmina de sèrum boví)

Per la determinació de proteïnes específiques es pot fer per:

Immunoelectroforesi, es fa migrar la mostra sobre un medi amb Ac. Quan la fracció proteica antigènica arriba a la zona d'Ac queda  retinguda i forma un arc

Immunodifusió radial, en una placa d'agar amb Ac, es practica un pouet a on es posa la mostra que es mou per difusió fins que arriba a l'Ac i queda fixada

Mètodes d'immunotransferència o Western Blot

Espectrometria de masses, el més habitual és utilitzar aquesta tècnica per determinació de proteïnes, però cada cop més s'utilitza lligada a tècnica cromatogràfica per quantificar

Les principals proteïnes plasmàtiques quantificades per mètodes immunològics són:

• Pre-albúmina, és un bon indicador de nutrició proteica sobretot en nadons i prematurs

Ceruloplasmina, en sospita de malaltia de Wilson

• Inhibidors de proteases, no només la α-antitripsina, també la antitrombina III, antiplasmina…
• Proteïna C Reactiva, és un dels millors indicadors de procés inflamatori, i els mètodes ultrasensibles, combinats amb un perfil lipídic, permeten predir malalties cardiovasculars

A l’interior de la cèl·lula la formació i destrucció de proteïnes és contínua, igual que a fora d’elles a on les hormones, i altres substàncies proteiques són assimilades o degradades via hepàtica.

Tot i el “reciclatge” d’aminoàcids, cal un aport extern per mantenir les necessitats fisiològiques. Le sproteïnes igerides en la dieta són degradades per les proteases gàstriques i pancreàtiques, donant lloc a aa’s que són absorbits pels enteròcits  i passen a la circulació pel sistema porta hepàtic.

A partir d’aquests aa’s que són absorbits per les cèl·lules, es produeix la síntesi de proteïnes com ja hem explicat

A les cèl·lules es produeix la degradació de les proteïnes intracel·lulars, procés catabòlic que no presenta problemes perquè els aa’s resultants es reutilitzen per la síntesi (anabolisme) de noves proteïnes

El problema apareix quan hi ha un excés de proteïnes en la dieta i en l’eliminació de les proteïnes plasmàtiques i no plasmàtiques per part del fetge

Els aa’s generen un esquelet carbonatat que es degradat a acetil-CoA i pot ser utilitzat com a precurssor en la lipogènesi, gluconeogènesi o entrar en el cicle de Krebs per obtenir ATP

Però també generen un grup amí que provoca una elevada toxicitat en l’organisme i que ha de ser eliminat eficientment per l’orina

Esquema general de les rutes anabòliques ↑ i catabòliques↓ L'Acetil-CoA és un metabòlit intermediari molt important doncs és precursor dels tres principis immediats principals i producte de la degradació dels tres p.i

La transaminació consisteix en la translocació o transferència del grup amí des de un α- aminoàcid a un α-cetoàcid que es converteix en una molècula de glutamat.

Els enzims responsables de la desaminació (ALT-alanin transferasa i AST-aspartat transferasa) són bàsicament hepàtics, i tenen un valor molt baix en plasma. Són enzims reversibles, poden desaminar els aminoàcids o afegir un grup amí. Quan apareixen problemes hepàtics com a conseqüència de dany cel·lular (hepatitis, cirrosi, intoxicacions…) les cèl·lules lisen i els enzims són abocats al plasma. Són les transaminases

El glutamat és desaminat per la glutamat deshidrogenasa (GGT), enzim hepàtic que amb consum energètic i poder oxidant del NADP allibera   el   grup   amí   en   forma   de    NH4+,i

regenera l' α-cetoàcid per què el pugui utilitzar

la ALT

El cicle de l'urea és el mecanisme utilitzat per les cèl·lules hepàtiques per desfer-se de l'amoni

A nivell mitocondrial una molècula de bicarbonat, un NH3 i un ATP s'uneixen per formar el carbamoïl fosfat.

Aquest compost entra en el cicle de l'urea que té lloc en la mitocondria i citosol de les cèl·lules hepàtiques

Al final es produeix una molècula d'urea que conté 2 grups amins, 1 provinent de  la desaminació dels aa's i l'altre de l'aspartat que entra en el cicle a nivell citosòlic

Es classifiquen en quatre tipus:

Alteració en la quantitat de proteïnes totals 1a) Hiperproteinemia

1b) Hipoproteinemia

1. Disproteïnèmies
2. Paraproteïnèmies

Crioglobulinèmies

Alteració en la quantitat de proteïnes totals, la suma total de proteïnes en plasma depenen de molts factors com l'edat, però estan al voltant dels 7,5-8 g/dL

1a) Hiperproteinemia, quan es produeix una hipovolemia per deshidratació es dóna un increment de la concentració proteica que afecta a totes les fraccions per igual.

Quan es dóna hiperproteinemia autèntica està lligada a un augment de les immunoglobulines

1b) Hipoproteinemia, pot ser deguda a un increment del volum sanguini per retenció de líquids. Si es produeix una disminució real de la fracció proteica sol ser deguda a disminució albúmina (causa renal o hepàtica) o a disminució gammaglobulines (causa renal o immunitària)

1. Disproteïnèmies, són alteracions en la distribució de les bandes electroforètiques
   1. Hipoalbuminèmia, deguda a disminució de la síntesi per desnutrició o IH. O per pèrdua excessiva renal en casos de síndrome nefròtic, alteracions gastrointestinals o grans cremats
   2. Hipogammaglobulinèmia, insuficiència del sistema immunitari
   3. Hiperglobulinèmia, quan afecta a les α globulines és degut sobretot a processos inflamatoris aguts però també tumors i necrosi dels teixits

Quan es dóna augment de α i β globulines sol ser degut a síndrome nefròtic

Quan afecta a les gamma globulines sol ser degut a processos inflamatoris, artritis reumatoide i hepatopaties

1. Paraproteïnèmies, presència en plasma d'una gran quantitat d'una Ig determinada  o d'una de les seves parts. Activitat excessiva i sense motiu d'un clon de LB, gammapatia monoclonal. Indicador de mieloma múltiple, leucèmies i limfomes. També pot ser degut a altres causes

1. Crioglobulinèmies, presència en plasma de proteïnes que precipiten quan descendeix la temperatura. Solen ser causades per problemes circulatoris en les regions distals de les extremitats o per vasculitis. Pel seu estudi es realitza el protocol d'extracció i manipulació de la mostra a temperatura de 37 oC, i un cop obtingut el sèrum es posa a 4-8 oC un mínim de 3 dies i s'observen les proteïnes precipitades