Preparación y Observación de Material Biológico: Técnicas de Microscopía

Preparación del Material Biológico

Fijación

Evita la digestión enzimática de tejidos y la autolisis celular. Formaldehído y glutaraldehído son los fijadores más utilizados.

Inclusión

Permite cortes muy finos y da consistencia rígida al tejido:

• Parafina: Microscopía óptica, consistencia similar a la gelatina.
• Resinas plásticas: Microscopía óptica y electrónica.

Previo a la inclusión

• Deshidratación: Inmersión en etanol al 70%.
• Aclaramiento: El etanol se sustituye por un disolvente orgánico (xilol), que convierte los fragmentos en translúcidos. Ej. Hígado rojo se torna translúcido.

El fragmento se sumerge en parafina a 58-60ºC, el disolvente se evapora y la parafina ocupa su lugar. Las resinas plásticas endurecen mediante polimerización de moléculas. En el micrótomo se realizan cortes entre 1-10µm. Fijación por congelación rápida: criotomo (operación rápida).

Tinción

Los colorantes permiten visualizar componentes específicos de la célula, como el núcleo. Tipos:

• Diferencian componentes ácidos y básicos de la célula.
• Distinguen componentes fibrosos de la matriz celular.
• Sales metálicas que precipitan en los tejidos.

Colorantes Básicos

Azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina (colorantes azules). Reaccionan con componentes tisulares que contienen ácidos basófilos: ácidos nucleicos, glucosaminoglucanos, proteínas ácidas.

Colorantes Ácidos

Eosina y fucsina (colorantes fuxias). Reaccionan con componentes tisulares cuyo pH es básico, acidófilos (filia por lo ácido): gránulos de secreción, proteínas citoplasmáticas, colágeno.

Con frecuencia se usan tinciones conjuntas (hematoxilina-eosina).

Otra forma de teñir: tricrómicos (tinción de Masson-Goldner).

• Pardo: Núcleo
• Rojo: Músculo, queratina y citoplasma
• Verde: Mucinógeno, colágeno

Microscopía Óptica

Microscopio de Campo Claro

No apto para tejido in vivo. Poder de Resolución (PR): Capacidad de presentar distintos y separados dos puntos adyacentes colocados a una distancia mínima. Límite de Resolución (LR): Distancia mínima entre dos puntos para que estos puedan distinguirse.

Microscopio de Contraste de Fase

Apto para tejido in vivo. El contraste se aumenta con la tinción, pero la célula muere. Microscopio de Nomarski: utiliza un prisma birrefringente (cuando incide sobre la lente un rayo de luz, emite dos rayos en la lente), lo que proporciona una imagen tridimensional (visión de relieve).

Microscopio de Luz Ultravioleta y de Fluorescencia

• Ultravioleta: No permite la observación directa ni de muestras in vivo.
• Fluorescencia: Compuestos químicos absorben luz ultravioleta y devuelven parte de la energía como longitud de onda más larga (longitud de onda corta). Utiliza dos filtros: 1º entre el foco y la muestra selecciona la longitud que absorbe la sustancia; 2º filtra la luz obtenida.

Microscopio de Polarización

Sustancias anisótropas o birrefringentes, con ordenación periódica de sus átomos, al incidir un rayo de luz, surgen dos. Utiliza un romboedro Nicol. Analiza tejidos con estructuras formadas por átomos y moléculas con elevado grado de orientación: colágeno, microtúbulos, tejido óseo, fibras musculares o nerviosas.

Microscopio de Barrido Confocal

Hace pasar la luz (fuente láser) a través de un objetivo que forma un haz bicónico y dirige los rayos a distintas profundidades de la muestra.

Microscopía Electrónica

Microscopio de Transmisión

Longitud de onda del haz de electrones menor que la de la luz visible, y a mayor velocidad del electrón, menor longitud de onda.

Microscopio de Barrido

Haz de electrones móvil que rastrea la muestra punto por punto. Se recubre la muestra con un sombreado metálico.

Observaciones de Muestras en Microscopía Electrónica

Se realizan en vacío, no in vivo. Los tejidos se protegen mediante fijación con: glutaraldehído (estabiliza moléculas proteicas) y tetraóxido de osmio (estabiliza las bicapas lipídicas). Cortes muy finos, ultramicrótomo.

Membrana Plasmática

Lípidos, proteínas de membrana (integrales, periféricas), glucocálix, intercambio de moléculas: endocitosis (pinocitosis, mediada por receptores, fagocitosis) y exocitosis.

Citosol

Componentes del citoesqueleto y orgánulos celulares.

Citoesqueleto

Microtúbulos, microfilamentos, filamentos intermedios.

Ribosomas

Orgánulos Membranosos

Retículo endoplasmático (rugoso, RER) y (liso, REL), complejo de Golgi, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas.

Núcleo

Envoltura nuclear, cromatina, nucleolos.

Ciclo Celular

Interfase (fase G1, fase S, fase G2), mitosis (profase, prometafase, metafase, anafase, telofase), citocinesis, muerte celular (necrosis, apoptosis).

Tejido Epitelial

Órganos formados por: parénquima, estroma, epitelios, glándulas, células epiteliales.

Tejido Conjuntivo

Células y matriz extracelular. Se origina del mesénquima (tejido embrionario que proviene del mesodermo).