Parámetros Esenciales en Validación de Métodos y Calificación de Equipos

Validación de Métodos Analíticos

Plan Maestro de Validación

Incluye la política de validación, estructura organizativa de actividades, instalaciones, equipos, procesos, protocolos, informes, planificación y programación, y referencias a documentos existentes.

Protocolo de Validación

• Principio básico del ensayo y tipo de muestra.
• Equipos y componentes involucrados.
• Ajustes y rangos de análisis.
• Reactivos y estándares de referencia.
• Preparación de la muestra (extracción, disolución).
• Preparación de la solución de referencia (Temperatura, tipo de agua).
• Procedimiento detallado paso a paso.
• Cálculos y reporte de datos.

Tipos de Métodos

• Método no normalizado: Métodos desarrollados internamente por el laboratorio, métodos nuevos (ej.: publicados en revistas científicas) o métodos tradicionalmente utilizados en el laboratorio.
• Método normalizado: Requiere validación si sufre una modificación significativa o se aplica en una matriz diferente.

Exactitud

Definición: Proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante el procedimiento y el valor verdadero.

Determinación de Impurezas

En el análisis cuantitativo de impurezas, la exactitud debe evaluarse en muestras con cantidades conocidas agregadas de impurezas.

Cálculo

Se calcula el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra (Recuperación) y la diferencia entre la media de la valoración y el valor verdadero aceptado (Sesgo).

Se recomienda realizar 9 determinaciones: 3 concentraciones diferentes con 3 réplicas cada una.

Determinación de la Exactitud (Según Resolución Exenta Nº 201)

1. Preparación de matriz con adición de estándares (si se dispone de los excipientes).
2. Preparación de muestra enriquecida con estándar (si no se dispone de excipientes).
3. Comparación de la curva de calibración de la muestra con la curva de calibración del estándar.

Nota: Realizar las determinaciones en niveles de concentración bajo, medio y alto.

Sesgo

Definición: La diferencia entre el valor esperado de los resultados de un ensayo o medición y el valor verdadero. Representa el error sistemático total, en contraposición al error aleatorio.

Recuperación (R)

Definición: Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) que se recupera durante el análisis. La recuperación indica el rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso de extracción y cuantificación del analito presente en la muestra original.

Precisión

Definición: Grado de concordancia entre los resultados de pruebas individuales realizadas bajo condiciones estipuladas. Se expresa comúnmente como la desviación estándar o el coeficiente de variación.

Niveles de Precisión

• Repetibilidad: Precisión bajo las mismas condiciones operativas en un corto intervalo de tiempo.
• Precisión Intermedia: Precisión dentro del mismo laboratorio (variaciones: días, analistas, equipos).
• Reproducibilidad: Precisión entre diferentes laboratorios (estudios interlaboratorio).

Evaluación de la Repetibilidad

Evaluar mediante:

• Tres concentraciones con tres determinaciones repetidas de cada concentración.
• Un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de prueba.

Determinación de la Precisión

1. Repetibilidad: Preparar 3 niveles de concentraciones independientes (bajo, medio, alto) y analizar cada uno en sextuplicado.
2. Precisión Intermedia: Preparar 3 niveles de concentraciones independientes (bajo, medio, alto) y analizar en sextuplicado bajo diferentes condiciones (días, analistas, etc.). Seleccionar el resultado más crítico.
3. Reproducibilidad: Generalmente evaluada para la transferencia de métodos entre laboratorios.

Evaluación Estadística de la Precisión

1. Repetibilidad: Calcular la desviación estándar (s) o el coeficiente de variación (%CV) de la serie de resultados. También se puede utilizar el estadístico F.
2. Precisión Intermedia: Calcular el coeficiente de variación (%CV) para cada nivel y comparar los resultados mediante métodos estadísticos (Ejemplo: ANOVA).

Selectividad (Especificidad)

Definición: Capacidad del método para cuantificar o cualificar inequívocamente al analito en presencia de otros componentes que se espera estén presentes (interferentes, matriz).

Determinación de la Selectividad

Analizar:

1. Un blanco de reactivos.
2. Una matriz natural o sintética libre del analito (blanco de matriz).
3. El analito disuelto en un solvente adecuado.
4. La matriz con una cantidad conocida agregada de analito o una muestra real.
5. Potenciales interferencias en presencia del analito.

Evaluación

Evaluar mediante la inspección de cromatogramas, espectros, pruebas de pureza de picos, etc.

Linealidad

Definición: Capacidad del método analítico para obtener resultados de prueba que sean directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra, dentro de un rango determinado.

Determinación de la Linealidad

1. Utilizar un mínimo de 5 concentraciones, preferiblemente espaciadas equidistantemente en el rango esperado.
2. Realizar de 3 a 5 réplicas independientes por cada concentración.

Evaluación

Evaluar mediante el análisis de regresión lineal y el coeficiente de correlación (r) o el coeficiente de determinación (r²).

Límite de Detección (LD)

Definición: La cantidad mínima de analito que puede detectarse en una muestra, pero no necesariamente cuantificarse con precisión y exactitud.

Determinación

1. Realizar una curva con al menos 3 puntos de principio activo en concentraciones cercanas al límite de detección estimado del equipo.
2. Calcular la relación señal/ruido (S/N) del equipo. Comúnmente, LD se estima donde S/N = 3.
3. Alternativamente, basado en la desviación estándar del blanco: LD = 3.3 × (Desviación Estándar del Blanco / Pendiente de la Curva de Calibración). (Nota: La fórmula LD = 3 x s requiere contexto, 's' podría ser la desviación estándar del blanco o de respuestas a niveles bajos).

Límite de Cuantificación (LC)

Definición: Es la mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar cuantitativamente con precisión y exactitud aceptables.

Determinación

Comúnmente, LC se estima donde S/N = 10. Alternativamente, basado en la desviación estándar del blanco: LC = 10 × (Desviación Estándar del Blanco / Pendiente de la Curva de Calibración). (Nota: La fórmula LC = 10 x s requiere contexto similar al LD).

Robustez

Definición: Medida de la capacidad de un método analítico para no ser afectado por variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros del método. Proporciona una indicación de su fiabilidad durante el uso normal.

Aptitud del Sistema (System Suitability)

Definición: Concepto que establece que el equipo, el sistema electrónico, las operaciones analíticas y las muestras a analizar constituyen un sistema integral que puede evaluarse como tal para asegurar el rendimiento del sistema antes o durante el análisis de las muestras.

Incertidumbre

Definición: Parámetro, asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mensurando (la cantidad que se mide).

Tipos de Evaluación de la Incertidumbre

• Tipo A: Evaluación de un componente de la incertidumbre mediante el análisis estadístico de los valores medidos obtenidos bajo condiciones de medición definidas.
• Tipo B: Evaluación de un componente de la incertidumbre de la medición realizada por medios distintos al análisis estadístico de series de observaciones (ej., datos de certificados, especificaciones del fabricante, literatura).

Revalidación

Definición: Proceso necesario cuando se realizan cambios en una metodología validada, se sustituye por un método nuevo, o hay cambios significativos en el proceso de fabricación del producto analizado. El grado de revalidación depende de la naturaleza del cambio.

Requisitos de Verificación (para Métodos Normalizados)

Confirmar que el laboratorio puede aplicar correctamente un método normalizado. Puede incluir la evaluación del efecto de la matriz sobre la recuperación de impurezas y fármacos desde la matriz del producto farmacéutico, la aptitud de las columnas y condiciones cromatográficas, y la adecuada respuesta de la señal del detector.

Recuperación (en Validación)

Definición específica en validación: Es la fracción de la sustancia (analito) agregada intencionalmente a la muestra (muestra fortificada) que se mide mediante el proceso analítico. Se utiliza para evaluar la exactitud del método, especialmente en relación con la extracción y posibles pérdidas.

Correlación Lineal (Evaluación Estadística)

(Sección incompleta en el original)

• M = P-EVALUE (Interpretación incierta sin contexto)
• t calculado > t tabla (Indica significancia estadística)
• H0 = rechazando (Se rechaza la hipótesis nula, ej., no hay correlación)

Espectroscopía Infrarroja (IR)

Regiones del Espectro

• IR Medio: 4000-400 cm⁻¹: Contiene vibraciones fundamentales y estructura rotacional de moléculas.
• Región de Grupos Funcionales: 4000-1400 cm⁻¹
• Región de la Huella Dactilar: 1400-400 cm⁻¹: Zona compleja, característica de la molécula completa (flexiones C-C, C-O, C-N, etc.).

Tipos de Vibraciones

• Vibraciones de Tensión (Stretching): Cambia la distancia (longitud) entre dos átomos unidos.
• Vibraciones de Flexión (Bending): Cambia el ángulo entre enlaces.

Bandas Características (Ejemplos)

• O-H (alcoholes, fenoles): Banda ancha alrededor de 3500-3200 cm⁻¹.
• N-H (aminas, amidas): Tensión 3500-3300 cm⁻¹ (puede ser simple o doble).
• C-H (alcanos, alquenos, aromáticos): Justo por debajo de 3000 cm⁻¹ (sp³), justo por encima de 3000 cm⁻¹ (sp², sp).
• C≡N, C≡C: ~2200 cm⁻¹.
• C=O (carbonilos): Tensión fuerte alrededor de 1700 cm⁻¹ (1680-1750 cm⁻¹, varía según el grupo: cetona, aldehído, ácido, éster, amida).
• C=C (alquenos, aromáticos): Tensión ~1600-1680 cm⁻¹.
• Benceno (sustituido): Bandas características en la región de 1600-1450 cm⁻¹ y sobretonos/combinaciones en 2000-1650 cm⁻¹. Bandas de flexión C-H fuera del plano en 900-690 cm⁻¹.
• Aldehídos (C-H del grupo CHO): Par de bandas débiles entre 2850 y 2700 cm⁻¹.
• Ácidos Carboxílicos (O-H): Banda muy ancha y fuerte centrada alrededor de 3000 cm⁻¹ (puede solapar con C-H). Tensión C=O ~1710 cm⁻¹.

Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

Índice de Insaturación (IDH o Grado de Insaturación)

Fórmula general para C_cH_hN_nO_oX_x (X=Halógeno):

IDH = c - h/2 + n/2 - x/2 + 1 (La fórmula original '#insa: 2C-H+N-X+2/2' parece incorrecta o incompleta)

• 4 insaturaciones: Sugiere la presencia de un anillo de benceno (3 dobles enlaces + 1 ciclo).
• 1 insaturación: Indica un doble enlace (C=C, C=O) o un ciclo en la molécula.

Análisis de Alimentos (Índices de Calidad en Grasas y Aceites)

• Índice de Acidez: mg de KOH necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en 1 g de muestra. Indica hidrólisis de triglicéridos.
  • Cálculo de % Ácido Libre (expresado como ácido oleico): (% Ácido Libre) = (mL NaOH × Molaridad NaOH × PM Ácido Oleico) / (10 × g muestra)
• Índice de Yodo: Gramos de yodo que pueden ser fijados por 100 g de muestra. Mide el grado de insaturación (dobles enlaces) de la grasa. Útil para comprobar pureza e identidad.
• Índice de Peróxido: Medida del oxígeno activo unido a las grasas en forma de peróxidos. Se expresa en miliequivalentes de oxígeno activo por kg de grasa (meq O₂/kg). Indica el grado de oxidación primaria (enranciamiento oxidativo).
• Índice de Saponificación: mg de KOH necesarios para saponificar (hidrolizar los ésteres) y neutralizar los ácidos grasos libres en 1 g de grasa. Relacionado con el peso molecular promedio de los ácidos grasos.

Calificación de Equipos e Instalaciones

Calificación de Diseño (DQ - Design Qualification)

Verificación documentada de que el diseño propuesto de las instalaciones, sistemas y equipos es adecuado para el propósito previsto. Incluye descripción completa de características y funcionamiento, requisitos de control sanitario, pretratamiento, tratamiento y distribución (ej., para sistemas de agua).

Calificación de Instalación (IQ - Installation Qualification)

Verificación documentada de que las instalaciones, sistemas y equipos, tal como se han instalado o modificado, cumplen con el diseño aprobado y las recomendaciones del fabricante. Se verifica la correcta instalación de componentes críticos.

Calificación de Operación (OQ - Operational Qualification)

Verificación documentada de que las instalaciones, sistemas y equipos, tal como se han instalado o modificado, funcionan como se espera en todos los rangos de operación previstos. Se realiza después de la IQ y antes del uso rutinario. Incluye pruebas funcionales y verificación de parámetros operativos.

Calificación de Desempeño (PQ - Performance Qualification)

Verificación documentada de que las instalaciones, sistemas y equipos, tal como se han conectado conjuntamente, pueden funcionar de manera efectiva y reproducible basándose en el método de proceso y las especificaciones aprobadas. Demuestra que el sistema total cumple consistentemente los criterios de aceptación bajo condiciones normales de operación.