Neisseria Meningitidis y Legionella Pneumophila: Diagnóstico, Patología y Tratamiento

Neisseria Meningitidis

Recolección y Transporte de Muestras

Las muestras útiles para el diagnóstico de enfermedad meningocócica incluyen líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre, aspirados, muestras de biopsia e hisopados nasofaríngeos y orofaríngeos.

LCR

Si se sospecha de meningitis meningocócica, debe obtenerse la mayor cantidad posible de LCR para cultivo, mínimo 1 ml, debido a que puede haber pocos microorganismos presentes. Las muestras de LCR deben ser llevadas personalmente al laboratorio después de su recolección y no deben refrigerarse. Se debe centrifugar y el sobrenadante debe guardarse para efectuar pruebas de detección de antígenos (Ag). Parte del sedimento debe utilizarse para preparar un frotis que se coloreará con Gram y el resto debe sembrarse en agar-chocolate y agar-sangre. También debe sembrarse con parte del sedimento un caldo suplementado de reserva.

Sangre

Se debe cultivar como se ha descrito para gonococos. La siembra directa de la sangre en frascos para hemocultivo es mejor que los tubos Vacutainer con SPS (polianetol sulfonato sódico) debido a los conocidos efectos inhibitorios del SPS sobre meningococos. Esta inhibición puede evitarse mediante el agregado de gelatina estéril al 1% al medio para hemocultivo.

Hisopos Nasofaríngeos

Son particularmente importantes para detectar colonización en individuos que son contactos íntimos de enfermedad meningocócica y para hacer encuestas entre portadores. Para tomar estas muestras, se introduce un hisopo fino montado sobre un vástago metálico flexible a través de la orofaringe hasta por detrás de la úvula, lugar donde se toma la muestra de nasofaringe. Estas muestras se inoculan en medio selectivo como agar Thayer-Martin modificado (TMM).

Biopsias

Deben ser llevadas personalmente al laboratorio en recipientes estériles. Las muestras deben ser humedecidas con caldo o solución fisiológica estériles y no deben ser refrigeradas. En el laboratorio, las muestras de tejidos deben ser fraccionadas asépticamente y cultivadas en agar chocolate y sangre. También debe colocarse parte de la muestra en un medio líquido adecuadamente suplementado como reserva.

Aislamiento a partir de Muestras Clínicas

El meningococo es un microorganismo exigente en las condiciones de crecimiento. Necesita factores nutricionales y es inhibido por un gran número de sustancias incluidas en los medios habituales. Las condiciones de incubación para N. meningitidis son iguales a las descritas para N. gonorrhoeae. Los meningococos se desarrollan bien en todos los medios selectivos para las neisserias patógenas. Los medios generales se emplearán en el aislamiento de Neisseria meningitidis a partir de muestras normalmente estériles, como líquido cefalorraquídeo o lesiones cutáneas. Para muestras contaminadas con flora acompañante, se emplearán medios selectivos como el agar Thayer-Martin o New York City (NYC).

En medio sólido, el meningococo crece dando colonias de 1-5 mm de diámetro, transparentes, no pigmentadas y no hemolíticas. Las especies capsuladas dan lugar a colonias de aspecto mucoso. Las placas se incuban a 35-37ºC en atmósfera de 5-10% de CO2 y no se deben descartar como negativas hasta 5 días después de su siembra.

Cuadro: Aislamiento de Neisseria meningitidis

1. Tinciones:
   • Tinción Gram: diplococos Gram negativos.
   • Tinción de cápsulas.
2. Siembra en medio:
   • Muestra estéril (LCR): agar sangre o chocolate.
   • Muestra no estéril: Thayer-Martin, Thayer-Martin modificado, New York City.
   • Incubar 24-48 h en atmósfera húmeda y 5-10% de CO2.
3. También puede hacerse la PCR.

Patrón Antigénico

Las cepas virulentas de N. meningitidis poseen cápsulas de polisacárido situadas en la parte exterior de la membrana externa. Se han descrito 13 serogrupos capsulares diferentes. Las cápsulas confieren resistencia a los microorganismos contra la fagocitosis. El meningococo posee además otros determinantes antigénicos como proteínas de membrana, los pilis que le permiten la adhesión a las células epiteliales y el lipopolisacárido, responsable de la mayor parte de los efectos tóxicos de la infección meningocócica. Asimismo, produce proteasa IgA.

El meningococo varía antigénicamente y puede ser serotipificado mediante anticuerpos (Ac) capsulares. La cápsula es un factor importante en la patogénesis que permite la inhibición de la fagocitosis. Ya está disponible una vacuna contra este antígeno capsular. Sin embargo, aún no se han realizado inmunizaciones efectivas contra el serogrupo B, que es el más común.

Patología

Es la segunda causa más común de meningitis dependiendo de la edad. El único reservorio es el hombre y se transmite de persona a persona. Generalmente no pasa de una infección banal de las vías aéreas superiores, pero en unos pocos casos se produce la enfermedad invasiva o meningitis. La edad es el principal factor que determina el riesgo de infección. Debido al pasaje transplacentario de Ac IgG maternos, el recién nacido está protegido contra la enfermedad (inmunización pasiva). Por ello, la población de mayor riesgo es la del grupo de entre 6 meses y 4 años. La inmunodeficiencia es un factor de riesgo: deficiencias primarias humorales combinadas, etc.

Neisseria meningitidis es solo patógeno en el hombre, al que coloniza a través de la nasofaringe. Los microorganismos se adhieren a las células faríngeas gracias a la presencia de los pilis. De aquí pueden pasar a la sangre y producir desde fiebre transitoria y bacteriemia hasta meningitis fulminante con muerte pocas horas después de la aparición de los síntomas. La manifestación clínica más grave de la enfermedad meningocócica es la meningitis. El comienzo de los síntomas meníngeos es brusco, con dolor intenso de cabeza, vómitos y rigidez de nuca. La presencia de meningococos en sangre se suele manifestar con la aparición de petequias, que son lesiones hemorrágicas de 1-2 mm de diámetro localizadas generalmente en el tronco y en la parte inferior del cuerpo. Estas lesiones son indicativas de complicaciones hemorrágicas y coagulopatías producidas por el microorganismo.

Neisseria meningitidis puede dar lugar también a artritis y, con menor frecuencia, neumonía, faringitis y uretritis. Las meningitis por Neisseria meningitidis suelen ocurrir por brotes epidémicos. Los niños entre 6-12 meses y los adolescentes son los que se afectan con mayor frecuencia. Un individuo puede tener colonizada su nasofaringe por el meningococo y sin embargo no desarrollar síntomas de infección; se conoce como portador. De un 5-30% de la población puede ser portadora de este patógeno en periodos interepidémicos. En épocas de epidemia, el estado de portador puede incrementarse hasta 70-80%.

Género Legionella

Introducción

La Legionella pertenece a la familia Legionellaceae y en la actualidad existen 29 especies reconocidas, 3 subespecies y 21 serogrupos. De ellas, la Legionella pneumophila es el patógeno humano más frecuente y el único que estudiaremos.

Características

• Cocobacilo o bacilo Gram negativo (se tiñe con dificultad en la tinción de Gram).
• Aerobio estricto.
• Requiere medios muy específicos. Todas necesitan L-cisteína para su crecimiento.
• Catalasa y oxidasa positivo.
• Produce una potente citotoxina responsable de las lesiones pulmonares.
• La mayor parte poseen flagelos, que le confieren movilidad y también pili.
• L. pneumophila hidroliza el hipurato, a diferencia de las demás especies, que son hipurato negativas.

Hábitat

Generalmente el agua (agua potable, aire acondicionado, condensadores...), donde resiste hasta 60ºC. Vive como parásito de amebas y protozoos. Es una bacteria ambiental capaz de sobrevivir en un amplio intervalo de condiciones físico-químicas. Los aerosoles que se generan en estos ambientes constituyen la fuente principal de infección.

Patología

Especie -> Legionella pneumophila -> Neumonía aguda.

MO -> Vías respiratorias -> Periodo de incubación (PI): 2-10 días -> Células respiratorias -> Enzimas -> Destrucción celular.

Síntomas

1. Fiebres altas:
   • Astenia.
   • Malestar generalizado.
   • Sin tos productiva.
2. Síntomas respiratorios:
   • Esputos sanguinolentos o purulentos.
   • Dificultad respiratoria.
   • Bradicardia.
3. Síntomas extrapulmonares:
   • Confusión.
   • Desorientación.
   • Náuseas.
   • Vómitos y diarreas.

El pronóstico de la neumonía atípica será más severo en ancianos o personas adultas con enfermedades debilitantes, aunque con el tratamiento preciso suele remitir sin problemas. Se da con mayor frecuencia en meses de verano y más frecuentemente en hombres que en mujeres.

También puede producir la Fiebre de Pontiac: cuadro semejante a la gripe.

• Fiebre.
• Tos.
• Mialgia.
• Náuseas y vómitos.
• Diarreas.
• Dolor torácico SIN NEUMONÍA.

Transmisión

Se transmite principalmente a través del aire. Se ha visto que numerosos brotes tienen que ver con la exposición al aire acondicionado. En hospitales, además del aire acondicionado, se han descrito otros aparatos como los humidificadores y nebulizadores, como generadores de aerosoles.

Diagnóstico e Identificación

Muestra

Generalmente respiratorias: aspirado traqueal, biopsia pulmonar, etc. En condiciones de total asepsia. El esputo es una muestra válida para el cultivo de Legionella. Todas las muestras respiratorias se enviarán en contenedores estériles con tapadera de rosca. Es necesario transportarla en hielo picado y almacenarlas a 4ºC en la nevera, hasta su procesamiento.

Diagnóstico Microbiológico

Examen Directo

• Inmunofluorescencia directa (IFD) (si es negativa no excluye la enfermedad).
• Sondas de ADN.
• Técnicas de inmunoensayo: ELISA, RIA.
• Gram y Giemsa poco útil.

Cultivo

(Antes hay que preparar la muestra) en medios selectivos:

• Los más utilizados:
  • Medio BYCE-& sin antibióticos (ATB). No es selectivo.
  • El mismo pero con ATB. Es selectivo.
  • Medio de Warren y Miller.
  • Medios alfacetoglutáricos.

Las placas se incuban a 35ºC en atmósfera de CO2 con humedad, durante un mínimo de 7 días; algunos laboratorios prefieren incubarlas dos semanas, antes de desecharlas como negativas.

Medio de cultivo -> Observación de las colonias: redondas y bordes lisos -> IFD sobre la colonia.

La identificación definitiva se realiza generalmente en laboratorios de referencia que utilizan métodos de hibridación, cromatográficos.

Pruebas no Microbiológicas

Diagnóstico Serológico

Se realiza mediante la determinación de anticuerpos frente a la Legionella por diversas técnicas, siendo de las más utilizadas la inmunofluorescencia indirecta. La ventaja de la demostración de antígenos de Legionella consiste en poder establecer un diagnóstico inmediato. Se ha realizado en esputo, suero y orina, pero la mayor concentración de antígeno se encuentra en la orina.

Diagnóstico Radiológico

No es frecuente la realización de radiografías de tórax en el momento del ingreso del paciente, y aunque los hallazgos son inespecíficos, como en cualquier otra forma de neumonía, aparecen infiltrados pulmonares únicos o múltiples, mal delimitados y localizados sobre todo en los lóbulos inferiores.

Género Neisseria

Características Generales

• Cocos Gram negativos.
• Aerobios estrictos.
• Generalmente se agrupan en parejas (diplococos) con aspecto de riñón o de granos de café.
• Inmóviles.
• Pueden presentar cápsula.
• Algunos producen un pigmento amarillo de naturaleza carotenoide.
• Oxidasa positivo.
• Catalasa positivo.
• Fermentan los carbohidratos con producción de ácido sin gas.
• Exigentes con los requerimientos nutritivos, inhibiéndose en presencia de ácidos grasos y sales.
• No resisten la desecación ni la exposición prolongada a la luz, y en estas condiciones elaboran enzimas autolíticas que conducen a su destrucción.

Hábitat

Se localizan habitualmente en las mucosas de los tractos respiratorio, digestivo y genitourinario del hombre y de los animales.

Patogenia

Los miembros del género que se encuentran en el hombre son:

• N. gonorrhoeae.
• N. meningitidis.
• N. lactamica.
• N. sicca.
• N. mucosa.
• N. flavescens.
• N. cinerea.
• N. polysaccharea y las subespecies de N. elongata.

Únicamente las especies Neisseria meningitidis y N. gonorrhoeae se consideran patógenos primarios y ambos infectan exclusivamente al hombre. Ambas especies se diferencian por el cuadro clínico que originan:

• N. meningitidis (meningococo) causa meningitis.
• N. gonorrhoeae (gonococo) causa gonorrea, infección del tracto genital primariamente.

Neisseria gonorrhoeae

Recolección de la Muestra

Deben recolectarse muestras de localizaciones genitales (uretra en el hombre, endocérvix en la mujer). Si el paciente tiene antecedente de contactos sexuales anogenitales y orogenitales, también es adecuado tomar muestras orofaríngeas y del canal anal. En los casos sospechosos de infección gonocócica diseminada, deben obtenerse hemocultivos y muestras de sitios genitales y extragenitales. Las muestras deben ser tomadas con hisopos de rayón. Los hisopos de algodón pueden ser tóxicos para ciertas cepas de gonococos; por lo tanto, este tipo de hisopos deben utilizarse solo si la muestra se siembra directamente en el medio de cultivo o es transportada en medio no nutritivo que contenga carbón para absorber o neutralizar los materiales inhibidores.

Transporte de la Muestra

Aunque la máxima recuperación de gonococos se obtiene cuando la muestra es sembrada directamente en medio de crecimiento después de la recolección, para las situaciones en que no puede hacerse se dispone de diferentes tipos de sistemas de transporte:

Sistemas no Nutritivos de Transporte de Hisopos

Los medios semisólidos tamponados de transporte de Stuart o de Amies pueden ser utilizados.

Siembras de Transporte con Medios de Cultivo

En estos sistemas, los medios se siembran con la muestra y se colocan en una bolsa de plástico impermeable que contiene un granulado de bicarbonato-ácido cítrico. El contacto del granulado con la humedad genera un ambiente rico en CO2 dentro de la bolsa.

Aislamiento a partir de Muestras Clínicas

El aislamiento del gonococo se realiza a partir de muestras no estériles procedentes del tracto genital y la orofaringe, fundamentalmente, que contienen gran cantidad de flora acompañante. Por ello, se recurre habitualmente al uso de medios selectivos que permitan su crecimiento inhibiendo al resto de microorganismos:

Medio Thayer-Martin

Se compone de agar chocolate suplementado con antibióticos:

• Colistina para inhibir bacilos Gram negativos.
• Nistatina para inhibir levaduras.
• Vancomicina para inhibir bacterias Gram positivas.

Medio Thayer-Martin Modificado

Sobre el medio anterior se han introducido modificaciones, como la inclusión del antibiótico trimetoprim, inhibidor de las especies del género Proteus, que crecen invadiendo la placa.

New York City

Contiene el mismo suplemento antibiótico que Thayer-Martin, aunque con diferente composición básica.

Además del empleo de un medio selectivo para el aislamiento de N. gonorrhoeae, es recomendable incluir un medio general como el agar chocolate, dado que el importante contenido antibiótico de los primeros impedirá el desarrollo de hasta un 10% de los gonococos.

Con objeto de favorecer el crecimiento de estas neisserias, es conveniente incubar las placas en una atmósfera húmeda y con un 5-10% de CO2. A las 24-48 h de incubación, las colonias de Neisseria gonorrhoeae son pequeñas (0,5-2 mm) y de color grisáceo.

Paralelamente al cultivo, se debe realizar un frotis de la muestra para tinción Gram. Los gonococos se observarán como diplococos Gram negativos incluidos dentro de los leucocitos polimorfonucleares. El examen directo de la muestra es muy útil cuando se realiza a partir de exudados uretrales y en menor grado de exudados endocervicales.

Neisseria meningitidis

Diplococo Gram negativo, bacteria aeróbica, inmóvil, capsulada (Nm) o meningococo. La mayoría de las especies del género Neisseria se incluyen en la flora bacteriana normal, tanto humana como animal. La transmisión de Neisseria se produce por la vía aérea superior de persona a persona, existiendo portadores sanos que transportan la bacteria en su mucosa respiratoria. Puede haber transmisión sexual del meningococo, lo que genera doble penetración.

Está ubicada entre las 10 principales enfermedades del ser humano, según la OMS, y debe ser considerada una emergencia infectológica. Las infecciones son más frecuentes en invierno y primavera y por lo común afectan a niños de corta edad, pero no hay un grupo etario que quede exento de esta enfermedad. Presenta 13 serogrupos definidos por el polisacárido capsular. El serogrupo B es la causa habitual de meningitis en los menores de 4 años, mientras que el C en los que superan esa edad. Suelen aparecer brotes epidémicos en forma esporádica que implican un incremento de las tasas de incidencia cada 8 a 12 años.