Métodos basados en el poder reductor de la glucosa

PRACTICA  No 5

DETERMINACIÓN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIÓN DE GLUCOSURIA

El mantenimiento de la glicemia, o concentración plasmática de glucosa, en los organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los órganos, al ser la glucosa un metabolito energético principal. La coordinación de los procesos metabólicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la relación insulina/glucagón. La ingestión de glucosa o sustancias que la produzcan (almidón, fructosa, galactosa, proteínas, pero no grasas) va seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este aumento origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilización de glucosa (por glucólisis, entre otras), aceleración de la glucogenogénesis y disminución de la glucogenólisis;
Todo ello ocurre principalmente mediante la secreción de insulina, una hormona pancreática de tipo polipeptídico. En el caso de que la producción de insulina esté disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las células, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglicemia)
; así ocurre en las personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo I".

El diagnóstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en antecedentes, síntomas clínicos y comprobación de una hiperglicemia significativa.

Experimento A:

DETERMINACIÓN DIRECTA DE LA GLICEMIA

(concentración de glucosa en suero)

*FUNDAMENTO TEÓRICO

Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de la concentración de glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera repentina y además  es severa. Una hiperglicemia superior a 124 mg/dL detectada en más de una ocasión en ayunas, además se considera también un valor mayor a 200 mg/dl en cualquier momento son indicativos de posible diabetes, diagnóstico que debe confirmarse con otras pruebas.
La determinación de glucosa sanguínea es una prueba muy frecuente en bioquímica y se puede llevar a cabo tanto por métodos químicos como enzimáticos, siendo estos últimos los más específicos.

** Hay dos tipos de métodos químicos:

a. Reducimétricos,que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido a la presencia en la muestra de otros compuestos reductores, estos métodos dan cifras superiores a las correspondientes a la glucosa verdadera. Ejemplos son el método de Folin-Wu y el de Somogy-Nelson.

B. Furfurálicos:

se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al sufrir deshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que emplea orto-toluidina.

** En cuanto a los métodos enzimáticos:

A. Método de la hexoquinasa:

emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una de NADPH, que puede medirse espectrofotométricamente a 340 nm. Es el método de referencia recomendado por las organizaciones internacionales.

B. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD):

es el que se utiliza en esta práctica para medir los niveles de glucosa sanguínea de la muestra problema y de los standares. Se explica a continuación:

- En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la D-glucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de hidrógeno. Éste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad de color será proporcional a la concentración de glucosa presente inicialmente. El esquema de la reacción es el siguiente:

*MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 10 ml.

- Pipetas.

- Espectrofotómetro.

- Agua destilada.

- Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).

Reactivo de color de glucosa, que contiene:
Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0

*PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se separará el suero. Hacer una dilución del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo 0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml de agua destilada, mezclar hasta homogenizar. Luego se preparan los siguientes tubos:

*Cálculos

Encontrar la concentración de glucosa en la muestra utilizando el método del factor de calibración.

* VALORES NORMALES

La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl.
Para el diagnóstico de diabetes se considera un valor mayor de glicemia en ayunas de 124 mg/dl ò mayor de 200 mg/dl en cualquier momento. Los pacientes cuyos niveles de glucosa se encuentren entre lo normal y lo diabético, son clasificados en una categoría denominada “tolerancia alterada a la glucosa” y requieren observación y pruebas confirmatorias.

Experimento B:

INVESTIGACIÓN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA

* FUNDAMENTO Teórico

En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo menos con los métodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria (presencia de glucosa en orina) se presenta en la diabetes mellitus pero cuando se supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuando la glicemia es mayor de 180 mg/dl.

Para la detección cualitativa de glucosa en orina se basa en la acción de la glucosa, que reduce las sales de cobre en medio alcalino por ebullición. Para ello utilizaremos el reactivo de Benedict el cual contiene: sulfato de cobre, citrato de sodio y carbonato de sodio.