Hibridación de Ácidos Nucleicos: Fundamentos, Tipos de Sondas y Aplicaciones

Bases Teóricas de la Hibridación

Desnaturalización

Propiedad del ADN consistente en la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. La desnaturalización se consigue aumentando la temperatura o el pH.

• Curva de fusión del ADN: Se mide la absorbancia a 260 nm.
• Temperatura de fusión (Tm): Temperatura a la cual la desnaturalización es del 50%. Depende de:
  • Longitud: En moléculas de menos de 500 pb, la Tm aumenta con la longitud.
  • Proporción de bases.

Renaturalización

Proceso por el cual las dos cadenas de una molécula de ADN separadas mediante desnaturalización térmica vuelven a reasociarse, al bajar lentamente la temperatura, hasta formar la doble hélice original.

Hibridación

El híbrido sonda/secuencia diana tiene las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de ADN en cuanto a desnaturalización y renaturalización. Las sondas usadas en las técnicas de hibridación suelen reconocer regiones de ADN o ARN de secuencia única.

Factores que influyen en la hibridación

• Fuerza iónica de la solución.
• Agentes desnaturalizantes y solventes orgánicos.
• Porcentaje de bases no complementarias (mismatch).

Tipos y Características de las Sondas

Características Generales

Pueden ser bicatenarias o monocatenarias y su tamaño puede oscilar entre el de pequeños oligonucleótidos y el de grandes moléculas de miles de nucleótidos.

• Especificidad: Capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que se tiene que hibridar. Se considera que el tamaño mínimo de la secuencia de una sonda para que sea específica debe ser de 16 bases.
• Sensibilidad: Probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana. Está en relación con el número de moléculas marcadoras que admite la sonda.

Sondas de ADN

Más utilizadas porque son fáciles de obtener en grandes cantidades y presentan una gran versatilidad en cuanto a tamaño y métodos de marcaje.

• De síntesis química: Son monocatenarias y pequeñas (<200 nucleótidos), las más habituales son inferiores a 40-50 nucleótidos.
• De ADN recombinante: Se obtienen por un proceso de clonación y amplificación por cultivo. Son bicatenarias, por lo que necesitan desnaturalización por calor como paso previo a la hibridación con las secuencias diana. Además, tienen mayor especificidad al ser de un gran tamaño.
• PCR: La obtención de sondas de ADN mediante PCR consiste en amplificar el fragmento que nos interesa como sonda mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

Sondas de ARN

Menos utilizadas que las sondas de ADN. Son siempre monocatenarias, por lo que no requieren un paso previo de desnaturalización antes de la hibridación.

• Ventaja: Los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables que los híbridos ADN/ADN.
• Inconveniente: Son muy sensibles a cualquier contaminación dada la omnipresencia de las ARNasas, que las degradan rápidamente.

Sondas Químicas Sintéticas de Ácidos Nucleicos

Sondas con modificaciones químicas sintéticas de los ácidos nucleicos, son menos empleadas que las de ADN o ARN. Incluyen sondas de ácidos nucleicos peptídicos o sondas de ácidos nucleicos bloqueados.

Marcaje de las Sondas

La mayoría utilizan reacciones enzimáticas y se basan en la incorporación a la sonda de nucleótidos marcados.

Marcadores que Posibilitan la Detección Directa del Híbrido

• Isótopos radiactivos: Elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones. Los más utilizados son el fósforo-32 (³²P) y el tritio (³H).
  • Técnicas en las que se utiliza: Southern blot, Northern blot y Dot blot.
• Fluorocromos: Compuestos químicos que emiten fluorescencia al ser excitados por luz UV. Se han desarrollado multitud de marcadores fluorescentes que se acoplan bien a los nucleótidos y no alteran la especificidad de la sonda, como las cianinas (Cy3, Cy5, Cy7) o el FITC (isotiocianato de fluoresceína). Las sondas marcadas con fluorocromos se utilizan principalmente en la técnica FISH.

Marcadores que Requieren Métodos Indirectos de Revelado en Varios Pasos

• Hapteno: Moléculas de pequeño tamaño que, al igual que los fluorocromos, se pueden acoplar a nucleótidos y no alteran la especificidad de la sonda.
  • Inmunohistoquímicos: Con un anticuerpo antihapteno marcado con un fluorocromo.
  • Enzimático: Con un anticuerpo marcado con una enzima que cataliza un producto coloreado. Los haptenos más utilizados son la digoxigenina y la biotina. Las enzimas más empleadas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.

Fases del Procedimiento

• Fase de prehibridación.
• Fase de hibridación: Formación del híbrido sonda/secuencia diana. Es importante tener en cuenta la Tm del híbrido. La mayor eficiencia de hibridación se consigue a temperaturas comprendidas entre –32 ºC y –16 ºC, siendo máxima a –25 ºC.
  • Tiempo de incubación de la sonda: Depende de la concentración de la sonda (entre 30 minutos y 24 horas).
• Lavado de poshibridación: Mantener los híbridos sonda/secuencia diana y eliminar los híbridos imperfectos con secuencias parecidas a la diana. Se realiza con un tampón en el que se fijan condiciones de rigurosidad.
• Fase de detección del híbrido:
  • Marcaje radiactivo: Tras el revelado de la placa de rayos X, la positividad de la hibridación se observa como marcas oscuras.
  • Fluorocromos: Las preparaciones se llevan al microscopio de fluorescencia. Al ser excitadas con la longitud de onda adecuada, se produce la emisión fluorescente del marcador que permite la visualización.
  • Haptenos: La detección se realiza por métodos inmunohistoquímicos con un anticuerpo antihapteno marcado con un fluorocromo o una enzima.

Técnicas de Hibridación

Técnicas de Hibridación en Soporte Sólido

Una de las dos moléculas implicadas, la secuencia diana o la sonda, se inmoviliza sobre un soporte sólido previo a la hibridación. Lo habitual es fijar al soporte la muestra que contiene la secuencia diana e incubar posteriormente con la sonda marcada para formar el híbrido.

• Dot blot: Técnica simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido y que permite detectar secuencias de ácidos nucleicos, ADN o ARN, en una mezcla compleja, sin aportar información adicional.
• Southern blot: Permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Permite la detección simultánea de varias secuencias diana de distintos tamaños con una única hibridación. Típicamente se utilizan sondas radiactivas (marcado ³²P), aunque pueden emplearse otros marcajes.
• Northern blot: Permite detectar moléculas de ARN separadas por electroforesis en gel y transferidas a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Es decir, es una técnica similar al Southern blot, pero optimizada para estudiar el ARN.
  • Aplicaciones:
    • Análisis de expresión génica.
    • Detección de mutaciones.
    • Estudios de corte y empalme o splicing alternativos.
• Microarrays: Conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN distintos fijados a una superficie sólida. Partiendo de una única muestra y realizando un único proceso de hibridación, un microarray detecta simultáneamente miles de secuencias distintas, cualitativa y cuantitativamente.

Técnicas de Hibridación in situ (ISH)

Permiten detectar y localizar secuencias de ácidos nucleicos (ADN y ARN) sobre cromosomas metafásicos, células y tejidos.

• ISH fluorescente (FISH): Utiliza sondas marcadas con fluorocromos, que son detectadas visualizando las preparaciones con un microscopio de fluorescencia con los filtros adecuados. Se realizan sobre cromosomas en metafase.
• ISH cromogénico (CISH): Se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un producto coloreado visible con un microscopio óptico convencional de luz transmitida. Se realiza principalmente sobre secciones de tejido FFPE (fijado en formol y en parafina). Se orientan más a la detección de secuencias que permitan precisar el diagnóstico anatomopatológico o aporten información pronóstica, más que a la detección de alteraciones cromosómicas.