Enzimas de Restricción y Secuenciación de ADN: Fundamentos y Aplicaciones

Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción son moléculas que provienen de bacterias y que cortan segmentos de ADN en una secuencia específica. Recortan específicamente una región de una secuencia conocida. Cortan enlaces fosfodiéster. Los cortes en enzimas de restricción pueden ser de dos tipos:

• Cortes cohesivos: Se producen en forma de escalera.
• Cortes romos: Se producen de forma recta.

Una enzima de restricción puede abrir fagos, plásmidos, etc., para poder hacer una clonación y poder tomar el ADN. El nombre de la enzima de restricción proviene del género, especie, cepa y número de la cepa. Por ejemplo, EcoR1 proviene de Escherichia coli.

La secuencia de la cadena molde es idéntica a la secuencia de la hebra complementaria para que se puedan reconocer los sitios de corte. El sitio de restricción debe ser palindrómico. Si está la secuencia específica, corta; si no la tiene, no se hace el corte.

Las enzimas utilizadas fueron HAEIII y Bst2. El producto de PCR tiene una longitud de 440 pb. Si las muestras son especies diferentes, podremos diferenciarlas, ya que se obtienen 3 perfiles de restricción diferentes. Las micobacterias tienen una alta variabilidad genética, lo cual nos permite diferenciarlas entre las especies.

Si la muestra no contiene los sitios específicos de corte reconocidas por las enzimas de restricción, al momento de observarlas en el gel solo se debe ver una sola banda. Si tengo solo un sitio de corte para una enzima de restricción, habrá 2 bandas; si tengo 2 sitios, habrá 3 bandas. Si tengo un producto de PCR y hay 4 sitios, habrá 5. La regla es: número de cortes + 1.

La combinación de las dos enzimas nos permite darle especificidad a la muestra. Entre más pequeños son los productos de PCR, el gel tiene que hacerse más concentrado.

Secuenciación de ADN

La secuenciación puede aplicarse como método para identificar las secuencias donde se encuentran los sitios específicos de corte de las enzimas de restricción. Permite determinar el orden de los nucleótidos en un fragmento de ADN. Ese orden de ácidos nucleicos va a tener un código, que los hace diferentes uno de otros.

Método de Sanger

La secuencia de Sanger, también conocida como método de Sanger o método dideoxi, o método de la cadena terminal, es una técnica común de secuenciación. Para que la enzima Taq polimerasa pueda sintetizar ADN, requiere que las cadenas se abran y amplifica cadenas de manera independiente, duplica la cadena sentido y la cadena antisentido.

Posteriormente, se tiene que pegar un iniciador; ese primer tiene que tener un extremo OH-3’ libre del nucleótido. La enzima sintetiza y puede colocar el siguiente nucleótido. La enzima Taq polimerasa llega y reconoce este sitio y pega más nucleótidos, siempre dejando el extremo 3-OH libre. A los nucleótidos se les conoce como dNTPs; la N puede ser adenina, citosina, timina o guanina.

Se tienen los 4 nucleótidos normales y un ddNTPs (dideoxinucleótidos). En cada tubo siempre habrá uno de los nucleótidos terminadores, por lo que la cadena de ADN se fragmenta y se obtienen fragmentos de diferentes tamaños. Se colocan los ddATPs, ddTTPS, ddCTPs, ddGTPs y, adicional a cada uno de ellos, se les coloca un color (fluoróforo). La cadena que se forma tiene un color y, al refractarla, proyecta un color cuando migra a través de un capilar que tiene corriente y los fragmentos pasan por un soporte sólido; migra por diferentes longitudes. Ese fragmento de un tamaño específico con un color específico permite saber qué base va pasando y se puede diferenciar cada una de las bases.

PCR en Tiempo Real

La PCR en tiempo real es una variante de la PCR. Las fases de una PCR son:

1. Desnaturalización: Se incrementa la temperatura para separar la cadena de ADN a 98ºC (Taq polimerasa).
2. Hibridación: Se reduce la temperatura (48 a 72 ºC) para permitir que los primers se peguen al ADN y a la cadena complementaria. Se colocan en posición 5’ a 3’ invertido para que vayan en sentido contrario a la síntesis.
3. Extensión: La polimerasa se extiende a una temperatura de 68 a 72ºC para formar nuevas cadenas de ADN.

La Taq polimerasa va a reconocer el extremo 3’-OH libre para colocar al siguiente nucleótido. Se obtiene un producto de PCR por medio de una amplificación logarítmica. En medio de la cadena se puede colocar una molécula que refracta. Cada que pasa un ciclo, el agente intercalante se mete en la cadena de ADN y produce fluorescencia. Si hay amplificación, se obtiene una curva clásica logarítmica.

Se incorporan fluoróforos en PCR con la intención de cuantificar la cantidad de ADN que se está generando, ya sea al inicio o al final. Para cuantificar es importante realizar una PCR en tiempo real. Cuando solo se quiere decir si está presente o ausente, solo es PCR. Cada vez que se hace una doble cadena, el fluoróforo se intercala y emite una señal que se detecta en un equipo llamado termociclador en tiempo real.

Si el fluoróforo no se incorpora adecuadamente al ADN, puede causar interferencia con los resultados emitidos debido al colorante libre que refracta luz sin la presencia de ADN. Se tomó una estrategia donde a un primer que está dentro del ADN se le coloca un fluoróforo y, para diferenciarlos, se le pone una sonda y marca con un fluoróforo; la sonda degrada al fluoróforo y se genera la emisión de una señal. Se usa un primer 1, un primer 2 y una sonda en el centro, y se libera cuando pasa la enzima; se detecta ciclo por ciclo.

Fases de la PCR en Tiempo Real

• Fase lineal: No se puede ver el ADN debido a que, como son billones de pares de bases, no hay la cantidad suficiente para que se observe.
• Fase de meseta: Es cuando ya se consumió la enzima, o ya no hay sonda y no se detecta más ADN.
• Fase exponencial temprana: Cuando empieza a subir. Si hay muy poco ADN, esta fase determina si hay o no amplificación.

En la curva, entre más cercano al 0, hay mayor cantidad de virus.