Electroforesis, FISH, CISH, Polimorfismos y Secuenciación: Técnicas de Análisis Genético Forense

Electroforesis

1. Preparación:

• Muestra: Antes de realizar la electroforesis, se aplican otros métodos de separación (centrifugación).
• Soporte: Se debe preparar el gel antes. Se mezclan los componentes y se usa un molde, dando el grosor y la textura adecuados.

Preparación del gel de agarosa:

• Hidratar la agarosa con solución tampón durante 10 minutos.
• Llevar a ebullición y dejar enfriar (55°C).
• Poner en el molde y hacer pocillos con un peine.

2. Disposición de alícuotas sobre el soporte:

• Moléculas con carga positiva (+): Alícuota cerca del ánodo para que las moléculas migren al cátodo.
• Moléculas con carga negativa (-): Alícuota cerca del cátodo para que migren al ánodo.

3. Electroforesis:

• Seleccionar parámetros eléctricos y tiempo. Poner en marcha el equipo.
• Se crea una diferencia de potencial y las sustancias comienzan a migrar por el soporte.

Resultado: Bandas de series invisibles sobre el soporte. Cada una corresponde a una sustancia diferente.

4. Revelado:

Poner de manifiesto las bandas o fracciones en que ha sido separada la muestra.

5. Lectura:

Interpretar la información que contiene el soporte y obtener el resultado.

• Identificar a qué sustancia corresponde y cuantificar.

ADN Repetitivo en Tándem

• Secuencias que se repiten en tándem con una localización cromosómica concreta.

ADN Satélite

• Mismas secuencias de ADN que se repiten miles de veces en tándem (100 kb a varios millones de bases). El más importante es el satélite alfa.

ADN Minisatélite

• Lo integran secuencias de 6 a 25 nucleótidos que se repiten en tándem.

ADN Microsatélite

• Secuencias cortas de entre 2 y 6 nucleótidos que se repiten un número relativamente pequeño de veces para originar fragmentos inferiores a 500 nucleótidos.

HUE GENE (Huella Genética)

• Combinación de alelos de varios marcadores genéticos que posee un individuo.
• Cuanto mayor sea el número de marcadores analizados y mayor sea el número de los alelos descritos para cada marcador, mayor será la probabilidad de que una combinación dada de alelos sea única e identifique de manera inequívoca a un individuo.

FISH Interfásico

Detección en núcleos interfásicos. Las sondas se diseñan según la anomalía a detectar, puede ser numérica o estructural.

Identificación de Anomalías Estructurales y Numéricas

• Sondas centroméricas (CEP): Hibridan el centrómero de cromosomas concretos (CEPx). Se emplean para el estudio de anomalías numéricas: aneuploidías y poliploidías.
• Sondas específicas de locus (LSI): Concretas de un cromosoma y específicas de una patología.

Identificación de Translocaciones

• Juegos de sondas que hibridan a ambos lados del punto de rotura.

Sondas de Separación

• Detectan translocaciones donde uno de los cromosomas implicados es siempre el mismo, pero el otro puede variar. La hibridación se realiza con dos sondas marcadas de verde y rojo que hibridan a ambos lados del punto de rotura en el cromosoma que siempre está implicado.

Sondas de Fusión

• Detectan translocaciones donde se conocen los dos cromosomas implicados. Se utilizan dos sondas, cada una hibrida un cromosoma.

CISH

La hibridación se detecta mediante reacción inmunohistoquímica.

• Es como FISH, pero se marca con haptenos y no requiere fluorescencia.

Polimorfismo de Longitud

Variación en la longitud de la secuencia de un locus debido a deleciones o inserciones de uno o más nucleótidos.

• En genética forense, tienen gran importancia los polimorfismos de longitud de ciertos minisatélites y microsatélites. Este polimorfismo de minisatélites y microsatélites permite diferenciar un individuo de otro, por lo que se habla de marcadores genéticos.

Polimorfismo de Secuencia

Variación de uno o más nucleótidos en la secuencia de un locus.

• Los de mayor interés para la genética forense son los polimorfismos de nucleótido simple o único (SNP), que consisten en variaciones puntuales de un nucleótido.

Secuenciación de Primera Generación

Método enzimático de terminación de cadena de Sanger y uso de cuatro fluoróforos como marca.

• Reacción de polimerasa: Se hacen dos PCR de secuenciación con un único primer.

Ventajas

• Menos cantidad de ADN a secuenciar.

• Se pueden realizar dos PCR:
  • PCR convencional de amplificación y PCR de secuenciación.

Por Terminadores Fluorescentes

• Se marcan 4 ddNTP, cada uno con un fluoróforo distinto.
• Añadir al tubo 4 ddNTP marcados en proporción adecuada.
• Al estar marcados con 4 fluoróforos distintos, el producto de la PCR se carga directamente en el secuenciador.

Con Primer Fluorescente

• Se utiliza el mismo primer, pero marcado con un fluoróforo distinto en cada tubo.
• En cada tubo se añade a la mezcla de reacción ddNTP en proporciones adecuadas. Se asocia un color fluorescente distinto para cada tubo.

PCR en Tiempo Real

Se monitoriza el proceso de amplificación por el empleo de productos fluorescentes, de manera que la detección del amplicón se realiza ciclo a ciclo.

Ventajas

• Mayor rapidez de detección.
• Cuantifica el ADN.
• Minimiza problemas de contaminación.

Cinética de la Amplificación

• Fase de ruido: Se obtiene fluorescencia de cada tubo. No asociada a los amplicones.
• Fase de crecimiento exponencial: Señal fluorescente que se detecta por presencia de amplicones, con gran pendiente y lineal.
• Fase de meseta: Otra vez lineal, más amplicones, pero las reacciones se van agotando.

Sistemas Fluorescentes de Amplificación

La master mix tiene fluorocromo, esa fluorescencia con el ADN se va intercalando.

• Dependiente de la secuencia o específica: Se utilizan sondas de oligonucleótidos que hibridan de forma específica en la región central del amplicón.
• Independiente de la secuencia: Empleo de agentes fluorescentes intercalantes, emiten fluorescencia y la amplían cuando se encuentran en ADN de doble hélice.

Aplicaciones

• Permite cuantificar la cantidad inicial de ácido nucleico en una muestra y la cantidad de ácido nucleico en cada ciclo.
• Cuanta más fluorescencia, más ADN. La máquina está conectada al ordenador y hay un excel.