Determinación de Triglicéridos en Suero: Método Enzimático

Práctica N° 10: Perfil Lipídico II - Triglicéridos

Introducción

Los triglicéridos constituyen la mayor parte del peso seco del tejido adiposo, representando una forma eficiente de almacenamiento de energía. El movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimentos del organismo ocurre rápidamente en respuesta a diversos estímulos como la dieta, la actividad física, el estrés y la edad. Por lo tanto, es esperable que la concentración de triglicéridos, uno de los principales vehículos para el transporte de ácidos grasos, varíe en respuesta a estos factores fisiológicos.

Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede alterarse, conduciendo a niveles anormales de triglicéridos circulantes. La persistencia de esta condición se asocia con numerosas patologías, tales como enfermedad hepática, renal, hiperlipidemias esenciales, etc.

Un caso de particular interés es el aumento de triglicéridos en individuos obesos, en los cuales tiene importancia pronóstica respecto a la probabilidad de desarrollar enfermedad cardíaca coronaria. Alrededor del 50% de los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son triglicéridos, por lo que es posible relacionar a los triglicéridos con la patogénesis de la arteriosclerosis coronaria. Este punto de vista está sustentado por el hecho de que un gran porcentaje de pacientes con infarto de miocardio también exhiben hipertrigliceridemia.

Fundamentos de la Determinación Enzimática de Triglicéridos

Para la determinación de triglicéridos en suero se utiliza la determinación enzimática de glicerol a partir de glicéridos. Los métodos enzimáticos se basan en la determinación del glicerol contenido en las moléculas de los triglicéridos, tras la hidrólisis (química o enzimática) para remover los ácidos grasos. La determinación enzimática del glicerol se ha usado durante muchos años; sin embargo, en estos métodos se empleaba la hidrólisis alcalina de los triglicéridos. El reciente desarrollo del uso de enzimas (lipasa, usualmente combinada con una proteasa) para catalizar la hidrólisis, ha posibilitado el empleo de métodos directos, rápidos y específicos. Los sistemas totalmente enzimáticos eliminan el uso de reactivos cáusticos, extracción con solventes, baños de altas temperaturas y mezclas de adsorción para la remoción de fosfolípidos. Estudios recientes se han concentrado en desarrollar reactivos con lipasas que hidrolizan completamente los triglicéridos.

Experimento A: Determinación de Triglicéridos en Suero

Fundamentos del Método

Se producen reacciones químicas basadas en la determinación química de glicerol a partir de glicéridos.

La primera etapa consiste en que los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente por una lipoproteína lipasa específica, produciendo glicerol y ácidos grasos.

En una segunda etapa, el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de glicerol kinasa.

En una tercera etapa, el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato oxidasa (GPO), con producción de agua oxigenada.

Finalmente, el agua oxigenada así formada produce la unión oxidativa del fenol y la 4-aminofenazona, en reacción catalizada por la peroxidasa (POD), con formación de una quinonimina roja.

Reactivos Provistos

• Estándar: Solución acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de triglicéridos.
• Buffer: Solución de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5.
• Enzimas: Viales conteniendo lipoproteína lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).