Determinación de Bilirrubina y Urobilinógeno: Metodología y Valores de Referencia

Para obtener la producción de color debido a ambas bilirrubinas, debemos añadir cafeína o metanol y tendremos la producción de un color debido a la suma de ambas bilirrubinas que llamamos Bilirrubina Total. Estos colores son comparados espectrofotométricamente con el color producido por una solución estándar de bilirrubina de concentración conocida.

Reactivos Necesarios

• Ácido Sulfanílico en medio ácido
• Solución acuosa de nitrito de sodio
• Alcohol metílico o solución de cafeína amortiguada
• Agua destilada
• Estándar de Bilirrubina
• Preparación de reactivo Diazo (Sol. Nitrito de sodio + Sol ácido sulfanílico), según instrucciones del profesor.
• Muestras problema

Metodología

Colocar los reactivos en tubos de prueba marcados, según la siguiente tabla:

Mezclar de inmediato, cada tubo por inversión.

Reposo 5 minutos a temperatura ambiente.

Lectura en espectrofotómetro en 530 nanómetros, colocando el espectrofotómetro en cero de Absorbancia con Agua destilada.

Anotar los resultados de cada lectura.

Cálculos

• Bilirrubina Total mg% = (T - B) x Factor
• Bilirrubina Conjugada (Directa) mg % = (D – B) x Factor
• Bilirrubina No Conjugada (Indirecta ó Libre) = (Bilirrubina Total – Bilirrubina Directa)

Valores de Referencia

• Adultos:
  • Directa: hasta 0.2 mg/%
  • Total: hasta 1.0 mg/%
• Recién nacidos:

  	Nacidos a término	Prematuros
  Sangre de cordón	2.5 mg%
  Hasta las 24 horas	6.0 mg%	8.0 mg%
  Hasta las 48 horas	7.5 mg%	12.0 mg%
  Del 3º al 5º día	12.0 mg%	24.0 mg%

Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento.

En los prematuros, los niveles de Bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad, dependiendo del grado de inmadurez hepática.

Experimento B: Investigación de Urobilinógeno en Orina

El Urobilinógeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y se encuentra en todas las orinas normales en muy pequeñas cantidades, menores de 4 mg / 24 hs. Se forma en el intestino como hemos señalado en las clases teóricas por la acción de las bacterias sobre los pigmentos biliares excretados por el hígado. También dijimos que luego que se excreta la bilirrubina conjugada al conductillo biliar llega al duodeno; la bilirrubina conjugada no es reabsorbida sino que o bien se excreta como tal en las heces, o bien se transforma en UROBILINOGENO (y derivados asociados) por acción de las bacterias del colon. El urobilinógeno se puede reabsorber en el intestino delgado (Íleon) y en el colon y pasa a la circulación portal, llega al Hígado y allí se re-excreta a la bilis y el resto llega al riñón y se excreta con la orina.

Cuando existe una alteración en la captación y excreción hepática de urobilinógeno (como en la enfermedad hepatocelular) o la síntesis de bilirrubina como en la hemólisis, la excreción diaria del urobilinógeno aumentará en forma significativa. Por el contrario, si no pasa bilis al intestino, como en la colostasis u obstrucción biliar extra hepática interfieren en la fase final del catabolismo de la bilirrubina y ocasiona un descenso notable en la producción y excreción urinaria del urobilinógeno. Entonces, la medida del urobilinógeno en la orina resulta muy útil para diferenciar las posibles causas de hiperbilirrubinemia como ocurre en la obstrucción completa de los conductos biliares, la urobilina estará ausente en la orina.

La excreción se incrementará en todas aquellas condiciones en que exista una excesiva destrucción de los eritrocitos y en aquellos casos de daño parcial del parénquima hepático. En las nefritis muy avanzadas puede estar ausente la Urobilina.

Fundamento de la prueba de Ehrlich para la investigación de Urobilinógeno en orina (Método Cualitativo)

Esta prueba se basa en la reacción entre el urobilinógeno y el reactivo de paradimetil aminobenzaldehído, para rendir un complejo coloreado rojo cereza.