Detección y Recuento de Bacterias Coliformes en Alimentos y Agua

Introducción

El grupo de **bacterias coliformes** incluye los géneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Dentro del grupo coliforme, solamente Escherichia coli es una bacteria de origen típicamente fecal y su presencia en un alimento o agua es **indicador de contaminación con materia fecal**. Ello implica que existe el riesgo además de la presencia de otras bacterias de origen fecal como son los patógenos Shigella y Salmonella. El término **coliformes fecales** corresponde a bacterias coliformes capaces de crecer en presencia de sales biliares y fermentar la lactosa con producción de gas a 44,5ºC. Entre los coliformes fecales predominan Escherichia coli biotipos I y II.

Fundamento del Método

El **Agar Violeta Rojo Bilis (VRBA)**, también conocido como **Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV)**, se utiliza en la enumeración de coliformes. Contiene peptona como fuente de carbono y nitrógeno, extracto de levadura como fuente de complejo vitamínico B, el cual estimula el crecimiento bacteriano. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de Gram positivos. La lactosa actúa como fuente de carbohidrato y el rojo neutro como indicador de pH.

Los organismos fermentadores de lactosa, como los coliformes, crecen formando colonias rojas con o sin zona de precipitación. En cambio, los no fermentadores de lactosa se desarrollan formando colonias incoloras a transparentes con o sin zona de precipitación.

Aplicaciones del Uso de Coliformes como Indicador Sanitario

La confirmación de coliformes mediante el traspaso de colonias aisladas a caldo bilis verde brillante permite diversas aplicaciones como indicador sanitario, entre ellas:

• Detección de **prácticas sanitarias deficientes** en el manejo y en la fabricación de los alimentos.
• Evaluación de la **calidad microbiológica** de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario cuando los coliformes son de origen no fecal.
• Evaluación de la eficiencia de **prácticas sanitarias e higiénicas** en el equipo.
• Determinación de la **calidad sanitaria del hielo** y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.

Material y Método

Material

• Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml
• Placas Petri de 100 mm de diámetro
• Tubos de fermentación de 18x180 mm y 16x160 mm
• Propipetas

Medios de Cultivo y Reactivos

• Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV)
• Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)
• Agua de dilución Butterfield
• Agua peptonada 0,1%
• Tinción de Gram

Método

Test Presuntivo

1. Preparar la muestra y diluciones según el procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua para análisis microbiológico, utilizando agua de dilución Butterfield.
2. Sembrar 2 diluciones en duplicado de la muestra en profundidad con RNCV. Inocular 4 placas Petri, 2 con 1 ml de dilución 10^-1 y 2 con 1 ml de dilución 10^-2.
3. Verter en cada placa 10 ml de RNCV temperado a 48ºC.
4. Mover las placas con movimientos rotatorios para mezclar la muestra y el medio de cultivo.
5. Cuando el agar esté solidificado, agregar aproximadamente 5 ml de RNCV temperado sobre la superficie del agar, formando una capa superficial para prevenir el crecimiento invasivo.
6. Dejar solidificar el agar e incubar las placas invertidas a 35 ± 1ºC durante 18 a 24 h. En alimentos lácteos, incubar a 32ºC.
7. Al término del período de incubación, seleccionar la dilución cuyas placas contengan entre 25 y 250 colonias. Contar las colonias sospechosas, tanto típicas como atípicas, y registrar el resultado multiplicando el número de colonias por la dilución correspondiente.

Colonias típicas: lactosa positivo, de color rojo intenso, con zona de precipitado de ácidos biliares, diámetro de 0,5 mm o mayor.

Colonias atípicas: pueden ser de color rosado, amarillento o café claro, con o sin precipitado.

Test Confirmativo

1. Seleccionar por lo menos 10 colonias sospechosas e inocular en caldo BVB conteniendo tubo de fermentación.
2. Incubar los tubos de caldo BVB a 35 ± 1ºC. Examinar los tubos por producción de gas a las 24 y 48 horas. Incluir tubos de medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo.
3. Al término del período de incubación, observar la formación de gas en los tubos de fermentación. Registrar como positivo aquellos tubos que presenten gas; la ausencia de gas se considera un test negativo.

Nota: Si los tubos de caldo BVB muestran una película, realizar tinción de Gram para asegurar que la producción de gas no fue debida al desarrollo de bacilos fermentadores.