Cromatografía: principios y tipos

Purificación de Productos Biotecnológicos

● Producto con una pureza específica dependiendo de su aplicación

● Preservar la actividad biológica de la molécula

¿Para qué purificamos?

Para eliminar impurezas específicas

¿Cuáles son las bases de la cromatografía?

● La cromatografía es un método de separación que se basa en las propiedades físicas y químicas de las moléculas para separarlas.

● Los componentes de una mezcla se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil de acuerdo con sus propiedades.

Cromatografía en Columna

Fase móvil: Es un gas o un líquido que fluye en la cromatografía.

Molécula de interés: Es el analito o molécula que se quiere separar o analizar.

Matriz cromatográfica (fase estacionaria): Matriz generalmente sólida donde interaccionan las moléculas, esta no fluye.

¿Cómo se separan los componentes?

● Los componentes que forman el extracto se mueven de manera continua entre la fase estacionaria y la fase móvil.

● Los componentes afines a la fase estacionaria pasarán más tiempo interaccionando con ella, es decir que no se mueven a la misma velocidad.

● Los componentes afines a la fase móvil se moverán con esta a la velocidad que fluye.

● La separación se da por las diferentes velocidades a las que migran los componentes con la fase móvil.

● Un componente se separa del resto de los componentes por el tiempo que se queda en la fase estacionaria.

● Todo depende de las interacciones de los componentes de la mezcla con las fases estacionaria y móvil.

¿Qué tipo de interacciones hay?

• Polares
• Electrostáticas
• De Van der Waals
• Hidrofóbicas

Parámetros Teóricos

● Tiempo de retención (tr): Es el tiempo en el que el soluto permanece en la columna.

● Tiempo muerto (t0): Tiempo en el que un soluto no interacciona con la fase estacionaria, representa el vacío en la columna.

● Tiempo de retención ajustado (tr’): Tiempo en el que el soluto permanece en la fase estacionaria, es la diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo muerto.

Factores de Retención

● Volumen de retención: Es el volumen de la fase móvil que se necesita para que el soluto se transporte desde la inyección hasta el detector.

● Resolución: Separación de 2 bandas, se define como la distancia entre los 2 picos entre el ancho de las bandas.

● Selectividad: Habilidad del sistema para distinguir entre solutos, puede ser visualizada entre la distancia entre las bandas.

● Eficiencia: Número de platos teóricos para alcanzar “equilibrio”.

Clasificación - Cromatografía

1) Según la fase móvil

a) Cromatografía de líquidos

b) Cromatografía de gases

2) Según la propiedad por la que se separan las moléculas

a) Tamaño

b) Carga

c) Afinidad

d) Hidrofobicidad

3) Según la metodología usada (Fase estacionaria)

a) Columna

b) Superficie plana

¿De qué formas puede ser llevada la elución?

Isocrática: La composición del eluyente se mantiene constante.

Gradiente: La composición del eluyente varía gradualmente.

• Lineal
• Escalonada

Tipos de Cromatografía

Cromatografía de Intercambio Iónico

Una molécula cargada se absorbe de manera reversible sobre una superficie con carga opuesta, se lleva a cabo por interacciones electrostáticas.

Intercambio catiónico (por las cargas negativas en el soporte)

Cromatografía de Exclusión Molecular (Filtración en Gel)

Separa las moléculas de acuerdo con su tamaño. Se utiliza como fase estacionaria un material poroso. La columna posee 2 volúmenes medibles: un volumen externo y un volumen interno.

¿Cómo funciona?

Las moléculas más grandes que los poros solo pasarán a través del espacio del volumen externo, las moléculas más pequeñas que el tamaño del poro eluyen dentro del volumen interno y en el volumen externo.

• Las moléculas más grandes migran primero.
• Las moléculas más pequeñas migran más lentamente.
• La migración dependerá de la forma de la proteína además del peso molecular.

Factores a considerar

• Matriz: Tamaño de poro, influye en la separación.
• Tamaño de la muestra y concentración: Se trabaja con volúmenes pequeños (1-5 % del volumen total de la columna). Debido a esto, esta cromatografía es de las últimas en realizarse. No trabajar con muestras muy viscosas. [proteína] no mayores a 20 mg/mL.
• Parámetros de la columna: Entre mayor longitud de la columna, habrá una mejor resolución.
• Fase móvil (elución): 0.1 M NaCl para evitar interacciones proteína-proteína.
• Velocidad de flujo: La resolución disminuye al aumentar el flujo.

Cromatografía de Interacción Hidrofóbica

Se da por la interacción de las regiones hidrofóbicas de las proteínas con una matriz hidrofóbica, a altas concentraciones de sal mejoran la interacción, a bajas concentraciones de sal hay menos interacción matriz-producto.

Cromatografía en Fase Reversa

• Se separan proteínas en función de su hidrofobicidad.
• Se usan solventes orgánicos para la elución.
• No recomendables para proteínas porque se desnaturalizan.

Cromatografía de Afinidad

Interacciones reversibles por afinidad a una molécula.

• Alta selectividad
• Alta resolución
• Alto grado de recuperación