Cinética de Amplificación en PCR a Tiempo Real: Aplicaciones y Sistemas Fluorescentes

Cinética de la Amplificación

Curva de Amplificación

La curva de amplificación es una curva de tipo sigmoide que se obtiene al representar la emisión de fluorescencia en cada ciclo PCR respecto del número de ciclo en el que se produce.

• Fase de ruido: Única fluorescencia debido a la señal fluorescente del fondo de cada tubo.
• Fase de crecimiento exponencial: Lineal y de gran pendiente, correspondiente a la producción de amplicones.
• Fase meseta: Lineal de pendiente reducida por la disminución de rendimiento en los últimos ciclos de PCR.

Sistemas Fluorescentes de Detección de Amplicones

• Independientes de secuencia: Se basan en el empleo de agentes fluorescentes intercalantes, se unen a la molécula de ADN y lo marcan (su inconveniente es la baja especificidad, se unen a cualquier molécula de ADN).
• Específicos de frecuencia: Utilización de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos que hibridan en la región central del amplicón (se usan fluorocromos asociados a la sonda, según el principio de transferencia de energía fluorescente por resonancia (FRET) para que solo emita fluorescencia y solo si se une al amplicón).

Tipos de Sondas

• Sondas de hidrólisis o TaqMan: Oligonucleótidos sintéticos que tienen un fluorocromo donante (notificador) en el extremo 5' y un quencher en el 3'.
• Balizas moleculares: Sondas oligonucleótidas específicas para PCR a tiempo real. Estas adquieren forma de horquilla con bucle, no detectándose fluorescencia del notificador. Usada para el final de la fase de hibridación.
• Sondas FRET: Parejas de sondas que hibridan en la zona central del amplicón en regiones adyacentes. La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación excitando el notificador (en 3') y detectando el quencher en 5'.

Aplicaciones de la PCR a Tiempo Real

1. PCR Cuantitativa a Tiempo Real

Permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra. Detecta el Cp (ciclo en el que se pasa de la zona de crecimiento exponencial). Cuanto mayor sea el número de secuencias diana, menos ciclos de PCR serán necesarios para alcanzar el Cp. Puede expresarse en términos absolutos o relativos.

• Cuantificación absoluta: Expresa el resultado final en unidades de concentración o número de copias por unidad de volumen.
• Cuantificación relativa: Expresa la concentración de la secuencia diana en relación con la concentración de un gen de referencia presente en todas las muestras con un número constante de copias.

2. Curvas de Fusión y Detección de Mutaciones

Curvas de fusión: Gráfica obtenida representando una fluorescencia frente a la temperatura (para obtenerla, bajar la temperatura a 60-65ºC y elevar lentamente hasta 95ºC. Si se han sintetizado productos no deseados, aparecerán varios picos).

• Curva con un único pico de fusión a la temperatura correspondiente al punto de fusión de la sonda: indica que el ADN molde no presenta mutaciones.
• Curva con un pico de fusión a temperatura menor al punto de fusión de la sonda: presencia de una mutación en homocigosis.
• Curvas con dos puntos de fusión, uno con temperatura de fusión de la sonda y otro menor: indica mutación por heterocigosis.

Requisitos sondas FRET:

• La sonda con el notificador tiene que hibridar en la región de la mutación.
• La sonda con el notificador debe tener una temperatura inferior a la sonda con el quencher.