Bioteknologia eta Ingeniaritza Genetikoa: Aurrerapenak eta Aplikazioak

Bioteknologia eta Ingeniaritza Genetikoa

0. Orokorrak

Bioteknologia

Bizidunak, bizidunetatik lortutako produktuak edo prozesu biologikoak erabiltzea gizakiarentzat interesgarriak diren produktuak lortzeko. Historikoki egin izan du gizakiak:

• Ogia egitean, edari alkoholdunak, esnekiak.
• Hautatutako animaliak gurutzatuz.
• Kultiboak hobetuz (landare erresistenteenak eta produktu onenak ematen zituztenak aukeratuz).

Ingeniaritza Genetikoa

Gene bat edo gene-talde bat manipulatuz (kanporatuz, txertatuz edo eraldatuz), zelulen eta bizidunen osaera genetikoa aldatzea ahalbidetzen duten tekniken multzoa da. Bioteknologiaren atala da.

1. DNAren Anplifikazioa (PCR)

Zer da PCR-a?

DNA-zati batekin lan egin ahal izateko, honen kopia ugari behar dira. Kopia hauek egiteko, gaur egun, bi teknika ezberdin erabili ohi dira:

• Klonazio molekularra edo klonazio genikoa: Zelula baten barruan sartzea DNA eta bertan erreplikatzea.
• PCR (Polimerasaren kate-erreakzioaren teknika): gaur egun gehien erabiltzen dena.

PCR-aren urratsak

• Jatorrizko DNA (moldea).
• Desoxirribonukleotido-trifosfatoak (kopiak egiteko).
• Zebadoreak: bi primer, kate osagarri bakoitzerako bana: batek hasiera markatuko du harizpi batean eta besteak bukaera beste harizpian. Beraz, erreplikatu nahi den zatia mugatzen dute.
• DNA polimerasa termoerresistenteak (ohikoena Taq polimerasa).
• Mg²⁺ ioiak: polimerasa entzimen kofaktorea.
• Tanpoi disoluzioa: pH aldaketak erregulatzeko.
• TERMOZIKLADOREA: tenperatura erregulatzen duen gailua.

PCR-aren erabilerak

Bioteknologian teknikarik erabilienetako bat da, DNA manipulatzeko lehenik kantitate nahikoa behar dugulako. Erabilera nagusiak:

• Genomaren sekuentziazioa.
• Infekzio-gaixotasunen diagnosia (*hurrengo diapositibetan garatua).
• Gaixotasun genetikoak detektatzeko (minbizia, adibidez).
• Pertsonen arteko bateragarritasuna ikertzeko (organoen transplanteen bideragarritasuna aztertzeko, adibidez).
• Aitatasun-amatasun probetarako.
• Gene zehatzen ikerketan kopiak lortzeko.
• Birus batzuk detektatzeko eta diagnostikatzeko: Adibidez: HIES-a eta SARS-CoV-2 birusa (primer egokiak gehituz, birusaren genoma soilik anplifikatuko da). PCR-a eta azido nukleikoko zundak behar dira.
• “Azido nukleiko zunda” = RNA edo DNA zatia, ezaguna den bere osagarriarekin lotuko dena. Birusaren gene espezifiko batentzako zundak erabiltzen dira birusa identifikatzeko.
• Birusaren material genetikoaren sekuentzia osoa jakinik (adibidez: Giza Immunoeskasiaren Birusarena eta SARS-CoV-2 birusarenak ezagunak dira), PCR bidez birusaren genoma anplifikatzen da, odol-laginetan edo ehun-laginetan errazago detektatzeko.

RT-qPCR

SARS-CoV-2 birusa detektatzeko erabiltzen den teknika da. Birusaren genoma RNAz osatuta dagoenez, lehenengo eta behin, alderantzizko transkripzioa egiten da RNAtik, DNAra, alderantzizko transkriptasa entzimaren bidez (hortik RT siglak = retrotranscriptase). Gainera, kasu honetan egiten den PCR-an anplifikatutako genomaren kantitatea kuantifikatu dezakegu (hortik, qPCR=quantitative PCR). Hau da, jatorrizko laginean, birusaren zenbat RNA molekula zeuden jakin dezakegu.

2. DNA Errekonbinantearen Teknologia

a) Zer da DNA errekonbinantea?

Espezie desberdinen DNA zatiak modu artifizialean konbinatuz lortzen den DNAri deritzo.

b) DNA Errekonbinantea: teknikaren urratsak

Ingeniaritza bitartez lortzen da urrats hauek jarraituz:

1. DNA zati espezifikoak lortu eta elkartu

DNA errekonbinantea sortzeko, errestrikzio-entzimak erabiltzen dira (murrizketa-entzimak, errestriktasak edo errestrikziorako endonukleasak). Entzima horiek DNA sekuentzia jakinetatik mozten dute. Errestrikzio-entzima mota bakoitzak leku jakin eta espezifiko batetik soilik mozten du DNA: errestrikzio-gunea ⟹ errestrikzio-entzima mota ugari. Errestrikzio-gune gehienetan sekuentzia palindromikoa izaten da ⟹ muturrak itsaskorrak izaten dira. Adibidez: EcoRI (Escherichia coli Restriction-enzyme I). Errekonbinatuko diren bi DNA zatiak errestrikzio-entzima berdinekin moztu ⟹ mutur osagarriak (itsaskorrak): Interesatzen zaigun DNA zatia = exogenoa. Bektorearen DNA gehienetan plasmidoa ⟹ Organismo desberdinen DNA zatiak konbinatu DNA ligasak erabiliz ⟹ DNA errekonbinantea lortu.

2. DNA errekonbinantea klonazio-bektoreetan sartzea

• Klonazio-bektorea: Bere baitan artifizialki sartutako beste espezie baten ADN zati bat daramaten ADN molekulak.
• Klonazio-bektoreak gai dira zelula ostalari baten barruan sartzeko eta behin eta berriro erreplikatzeko.
• Klonazio-bektoreen ezaugarriak:
  • Guztiz autonomoak izan behar dira: zelula ostalariaren barruan bere kabuz erreplikatzeko gai.
  • Klonazio-bektore bakoitzak errestrikzio-entzima bakoitzerako errestrikzio-gune bakarra izan behar du.
  • Hautaketarako balio duen markatzaileren bat izan behar dute: zelula ostalariak ez duen entzima kodetzen duen genea edo ostalariak ez duen ezaugarriren bat eragiten duena. Adibide ohikoena: antibiotikoekiko erresistentzia ematen duen genea.

Bektoreen erabilerak:

Plasmidoak

Bakterio askotan agertzen diren DNA zirkular txikiak dira, bere kabuz erreplikatzen direnak (hau da, ez dira erreplikatzen bakterio kromosomarekin batera). Adibidez: pUC18 plasmidoa oso erabilia da (Plasmid University of California): aldez aurretik genetikoki manipulatuta dago. pUC18 plasmidoak bi gene ditu sartuta: ampR genea, anpizilina antibiotikoarekiko erresistentzia ematen duena, eta lacZ genea, β-galaktosidasa entzima kodetzen duena. Entzima horrek laktosa hidrolisatzen du eta kolore urdina duen substantzia bat askatzen du. EcoRI errestrikzio-entzimaren errestrikzio-gunea da LacZ genea (plasmidoaren errestrikzio-gune bakarra).

Birus Bakteriofagoak

Lambda deituriko bakteriofagoak oso erabiliak dira. Beste espezie baten DNA zatiak DNA biralean tartekatzen dira. Birusek, zelula ostalaria infektatzen dutenean, genoma birikoarekin batera gene hori ere txertatuko dute zelula ostalariaren genoman.

Kosmidoak

Bektore hibridoak dira: lambda bakteriofagoaren kromosoma zatiak eta plasmidoen DNA zatiak erabiliz eraikitako bektoreak dira. Birusaren zatiak dituenez (“cos” zatiak) bakteriofagoetan paketatzea egin daiteke. DNA zati handiagoak txerta daitezke.

3. Klonazio-bektoreak zelula ostalarietan sartzea

Transformazio bakterianoaren bidez sartzen dira plasmidoak bakteria barrura = TRANSFEKZIOA: Bakterio espezie batzuek inguruan edo medioan dauden DNA zati biluziak barrura biltzeko gaitasuna dute. Baldintza naturaletan, bilketa hori oso poliki gertatzen da; laborategian prozesua bizkortu daiteke kaltzio kloruroa erabiliz. Bakterio-ostalari erabiliena: Escherichia coli. Transfekzioz lortuko dira: Plasmido gabeko bakterioak, errekonbinatu gabeko plasmidoak bildu dituzten bakterioak, eta plasmido errekonbinanteak dituzten bakterioak.

4. Plasmido errekonbinanteak dauzkaten bakteriak aukeratzeko

Petri plaka batean, anpizilina antibiotikoa eta X-gal substantziak dituen hazkuntza-medio bat prestatu eta bakterioak kultibatu: Inolako plasmidorik bildu ez duten bakteriek ez dute ampR genea izango (markadorea), eta gene horrek ematen du antibiotiko horren aurkako erresistentzia ⟹ ez dira garatuko. Plasmidorik bildu duten bakterioak garatu egingo dira. Plasmidodun bakterioen artean, errekonbinanteak ez diren plasmidoak dauzkaten bakterioek β-galaktosidasa osorik kodetzen duen genea edukiko dute ⟹ X-gal substantzia hidrolizatuko dute ⟹ koloniek kolore urdina izango dute. Plasmidodun errekonbinanteak dituzten bakterioek β-galaktosidasaren genea aktibatu gabe izango dute (bertan txertatu baita hartutako genea) ⟹ ezingo dute X-gal hidrolizatu ⟹ koloniek kolore zuria izango dute. Horra hor nola identifika eta bereizi daitezkeen giza geneekin errekonbina daitezkeen plasmidoak dauzkaten bakterien koloniak.

c) DNA Errekonbinantearen Erabilerak

Kolonia bateko bakterioak genetikoki berdinak dira ⟹ klonak. Klon bakterianoan sartutako gene kanpotarra (arrotza) ⟹ mRNAra transkribatu ⟹ proteinan itzuliko da. Inguru aproposean daudenean, bakteriak oso azkar zatitzen dira ⟹ proteina horren kopuru handiak lortu ahal izango ditugu. Adibidez: giza-intsulina proteina edo giza-hazkuntza hormona.

Gehiago Jakiteko:

Prokariotetan eta eukariotetan transkribatzeko eta itzultzeko prozesuak ezberdinak dira ⟹ arazoak. Promotoreak ezberdinak dira (promotoreak: RNA polimerasari transkripzioa hasteko adierazten dioten sekuentziak) ⟹ bakterio batek gene eukarioto bat adieraz dezan ⟹ promotore prokarioto egoki bat behar da bakterioaren RNA polimerasak transkripzioa egin dezan. Bukaera-seinaleekin ere gauza bera gertatzen da. Gene eukariotoetan introiak daude eta prokariotoetan ez ⟹ mRNA bakteriarrak ez du madurazio-prozesurik behar. Proteina askok, funtzionalak izateko, talde prostetiko lipidikoak edo gluzidikoak inkorporatu behar dituzte; baina bakteriek ez dute eraldaketa hori egiteko gaitasunik. Laburbilduz, organismo prokariota batean gene eukariota bat espresatzeko, promotore egokiak gehitu behar dira, eta baita transkripziorako eta itzulpenerako ezinbestekoak diren beste faktore batzuk ere. Konponbidea: Eragozpen horiek ekiditeko modu bat da gene eukariotak legamiatan klonatzea bakterioetan klonatu beharrean. Legamiak zelula eukarioto bakarreko onddoak baitira, eta, gainera, plasmidoak ere bai baitituzte.

3. Elektroforesia

a) Zer da Elektroforesia?

Elektrikoki kargatutako molekulak (DNA molekulak) tamainaren arabera banatzea ahalbidetzen duen teknika da. Elektroforesiaren funtsak: Agarosazko edo poliakrilamidazko gelak ⟹ eremu elektriko bat sortzen da gelean polo (+) eta (-) arekin. Gel horiek sare moduko bat osatzen dute, dentsoa. DNA zatiak gelaren poroetan zehar higituko dira (karga eta tamaina): DNA molekulek karga negatiboa dutenez (fosfato-taldeak), polo negatibotik positibora joango dira poliki-poliki. DNA zatiak tamainaren arabera banatuko dira: Txikienak urrutiago helduko dira (azkarrago), eta handienak gertuago geldituko dira. Lagin bakoitzean, luzera desberdinetako ADN zatiak poliki-poliki migratzen joaten dira polo (+)rantz. DNA molekula bat errestrikzio-entzimaren bidez zatitu ondoren, elektroforesia: DNA zati desberdinak tamainaren arabera ordenatzen direnez, banda-patroi bat lortzen da. DNA molekula bakoitzak, banda-patroi zehatz bat ematen du (errestrikzio-entzima bakoitzarekin). Hau da, banda-patroia DNA molekula bakoitzaren eta erabilitako errestrikzio-entzimaren adierazgarria da. Kontuan izan: Izaki bakoitzak DNA sekuentzia desberdina du ⟹ bi izakiren DNA errestrikzio-entzima berberarekin hidrolizatuz ⟹ errestrikzio-zati desberdinak ⟹ pertsona bakoitzak DNA-k banda-patroi desberdina.

b) Elektroforesiaren Prozedura

Aztertu nahi den DNA anplifikatzen da PCR bidez (kantitate nahikoa izateko). Errestrizio-entzimaren bidez zatitzen da, tamaina desberdinetako zatiak lortzeko (murrizketa zatiak edo errestrikzio-zatiak). Agarosazko gelean polo (-)an kokatzen dira laginak eta polo(+)rantz migratzen dute poliki-poliki, tamainaren arabera banatuz. Elektroforesian agertutako banda-patroia aztertzen da.

c) Elektroforesiaren Erabilerak

Pertsona bakoitzaren DNAak nukleotido-sekuentzia desberdin bakarra ⟹ bi pertsona desberdinen DNA errestrikzio-entzima berberarekin moztuz gero ⟹ murrizketa-zati desberdinak lortuko ditugu ⟹ elektroforesia eginez pertsona bakoitzaren DNA-k banda-patroi desberdina eta bakarra erakutsiko du. Hori da DNA AZTARNA edo DNA FINGERPRINTING-a. DNA aztarnaren erabilerak: Biologia forensean egilea aurkitzeko: Delitu hori egin den lekuan DNA aurkitzen bada, susmagarriaren DNArekin konparatu daiteke. Aitatasun-probak egiteko (seme-alaba eta aita posiblearen DNA konparatzeko). Medikuntzan: Gaixotasun genetiko batzuen diagnostikoa egiteko.

4. DNAren Sekuentziazioa

a) Zer da DNAren Sekuentziazioa?

DNA molekula batek duen nukleotido-sekuentzia ezagutzea da helburua. Zein nukleotido eta zein ordenatan dauden jarrita zehaztea. DNA sekuenziatzeko teknikarik erabiliena: SANGER metodoa = DIDESOXI metodoa = metodo entzimatikoa. Gaur egun laborategietan teknika hau automatizaturik ⟹ Sekuenziatzaile izeneko tresna batzuk erabiliz egiten da. Sekuentziazioaren funtsak: Teknika honetan dNTP arruntez gain, didesoxirribonukleotido trifosfatoak (ddNTP) erabiltzen dira: ddNTP-etan, karbono 3’ren OH ordez, H daukagu, eta, horregatik, DNA kate batera ddNTP bat lotzeak katearen luzapena eten egiten du (ez duelako -OH talde askerik DNA polimerasak bere lana jarraitzeko).

b) DNAren Sekuentziazioaren Prozedura

Saiodi batean gehitu: DNA moldea, Primerra edo zebadorea, DNA polimerasa entzima, Desoxirribonukleotido trifosfatoak (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 2’ 3’ Didesoxirribonukleotido trifosfatoak (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP, bakoitza kolore desberdin bateko molekula fluoreszente batekin markatuta). DNA polimerasa lanean hasiko da primerraren 3’ -OH muturrean DNA moldeari dagozkion nukleotido osagarriak gehituz. Halako batean, dNTP lotu beharrean, ddNTP lotzen bada, hurrengo nukleotidoa ezin denez lotu, hor bukatuko da DNAren sintesia. Horrela, zoriz, luzera desberdinetako DNA zatiak sintetizatuko dira, bakoitza, fluorescentziarekin markatutako ddNTP batean bukatuta. Ondoren, elektroforesia eginez gero, luzera desberdinetako zatiak banatzen dira, eta badakigunez, zati bakoitzak zenbat nukleotido dituen, eta zein nukleotidotan bukatzen den, sekuentzia osoa jakin ahal izango dugu. Elektroforesi bidez banatutako zatiak laser bidez argitzen dira, eta bakoitzak kate amaierako ddNMPari dagokion koloreko argia emango du.

c) DNAren Sekuentziazioaren Erabilerak

• Gaixotasun genetikoen mutazioen detekzioa (odol edo ehun laginekin): DNA + Aztertu nahi den genearen primer: PCR (DNA anplifikatu) eta ondoren genearen sekuentziazioa ⟶ normala den edo mutazioa duen ikusteko. Horrela gene mutatua dagoen jakingo dugu: Gaixo asintomatikoak, jaio aurretik, gene anormal azpirakorrik baduten edo ez zehaztea.
• Diagnosi genetikoa erabiltzen da: anemia faltziformean, fibrosi kistikoan, Huntington gaixotasunean edo Duchenne-ren gihar-distrofian.
• Antropologian, aurkitutako DNA sekuentziatu eta espezieen arteko ahaidetasunak antzemateko.
• Birusen genoma sekuentziatzea, zepa edo andui desberdinak identifikatzeko, eta txertoa diseinatzeko.

5. CRISPR Teknologia

Nola funtzionatzen du bakterioen defentsa-mekanismo horrek?

Birus batek bakterioa infektatzen duenean, bakterioak bi gauza egiten ditu: CAS proteina sintetizatzen du (endonukleasa bat da eta birusaren genoma moztuko du artazi bat izango balitz bezala), baina erakutsi egin behar zaio nondik (zein sekuentziatik) moztu behar duen ⟶ CRISPR sekuentziak eta Bakterioak, bere genoman duten CRISPR-eko espaziadoreetan birus horren DNA zatiak izaten ditu gordeta ⟹ DNA zati horiek transkribatuko ditu RNAra. RNA hori, infekzioa eragin dion birusaren genomaren osagarria dena, CAS proteinarekin elkartuko da. Bien artean, birusaren genoma aurkitu eta moztu egingo dute, birusa inaktibatuz. Bakterio bat birus ezezagun batekin infektatzen denean, birusaren genomaren zati bat gordetzen du CRISPR-en, espaziadoreetan, hurrengo batean, bere aurka egiteko. Laburbilduz: CRISPR-CAS sistema: CRISPR-ek gidatzen du CAS, sekuentzia zehatz bateraino, bertatik DNA mozteko.

a) CRISPR-CAS Sistemaren Garapena (geneak editatzeko tresna programagarria)

Nola funtzionatzen du CRISPR-CAS sistemak? EDIZIO GENETIKOA

DNA zati zehatzak ezabatzeko, gehitzeko edo aldatzeko erabil daiteke. Gaur egungo CRISPR-Cas9 sistemak oinarrizko bi elementu ditu: Cas9 entzima endonukleasa, DNA kate bikoitza mozteko gaitasuna duena, eta RNA gida, honek Cas9 nahi dugun lekuan kokatzen du, bertatik DNA mozteko. Horretarako lehenik, moztu nahi dugun DNA sekuentzia zein den aztertu behar da eta horren osagarria den RNA gida diseinatzen da. Bi osagaiak zeluletan sartzean: RNA gidariak aldatu beharreko genomaren eremua (sekuentzia) ezagutzen du eta Cas9 nukleasa posizio horretara eramaten du eta Cas-9 endonukleasak DNA moztuko du posizio horretatik. Zelulak DNAn akats bat dagoela detektatzen du eta DNA konpontzeko mekanismo naturalak aktibatzen ditu, moztutako DNA konpontzeko. Ondorioz, zelulak DNAn akats bat dagoela detektatzen du eta DNA konpontzeko mekanismo naturalak aktibatzen ditu, moztutako DNA konpontzeko: Batzuetan, konponketa ez da zehatza eta nukleotido batzuen galera edo irabazia dakar, DNAan ezabatze edo txertatze mutazioak sortuz. Mutazioak gene baten barruan daudenean, genea inaktiba dezakete. Horrela, CRISPR-Cas9 sistema, guk nahi dugun gene baten eskualdera bideratuz, gene hori inaktiba daiteke. Moztutako DNA konpontzeko zelulari DNA zatitxo bat sartzen badiogu, zelulak DNA hori sar dezake konponketa egiteko: DNA sekuentzia sartzea lortzen dugu. Batzuetan gene bat moztuz inaktibatzen dugu eta gaixotasun genetiko bat sendatzen da. Beste batzuetan, gaizki dagoen gene bat moztu eta inaktibatu ondoren, genearen kopia zuzena txertatu behar da, gaixotasuna sendatzeko.

b) CRISPR-CAS Teknologiaren Arazoak

Teknologia hau oraindik guztiz garatu gabe dago (nahi ez dugun leku batetik moztu dezake DNA). Enbrioiak genetikoki aldatzen baditugu, aldaketa genetiko horiek hurrengo belaunaldietara pasatuko dira, eta beraz espeziea aldatuko da (gizakiak determinatuko du espezieen eboluzioa). DNA moztu ondoren, zelulak berak konpontzen du DNA ahal duen bezala, eta behar bada, konponketa ez da egokia.

6. Ingeniaritza Genetikoaren Aplikazio Praktikoak

a) Terapia Genikoa

Helburua: gaixotasun genetikoak sendatzea. Gaixotasuna monogenikoa denean egiten da (gene bakar batek eragindakoa). Akatsduna den genearen ordez, gene zuzena txertatzean datza, proteina zuzena ekoiz dezan. Birusak erabiltzen dira bektore moduan, gene zuzena txertatzeko zeluletan. Indibiduoen zelula somatikoetan egiten da, beraz, genea adierazten den gorputz-ataletako zeluletan egin behar da. CRISP-CAS teknologia gero eta erabiliagoa da, aurrerapen nabarmenak eta itxaropentsuak lortuz. Bi modutan egin daiteke: “In-vivo” edo “ex-vivo”. Zelula somatikoetan erabiltzen da, beraz, ordezkapen hori betiko izan dadin, bizitza osoan zehar zatitzen diren zeluletan egin beharra dago ⟹ ama-zelulak (erne-zelulak). Adibidez: Leuzemiaren kasuan, hezur-muineko ama-zelulak erabiltzen dira, (zelula horietatik sortzen baitira odol-zelulak eta sistema inmunologikoko zelulak).

Terapia genikoaren prozedura

Gene normala isolatu eta klonatu. Genearen RNA osagarria lortu. RNA hori, ugaltzeko gai ez den erretrobirus batean sartu. Erretrobirus horrekin, jarraian, lehenagotik gaixoari ateratako eta laborategian kultibatutako zelula batzuk infektatu: Alderantzizko transkriptasak RNA birikoa DNA bihurtuko du, eta DNA hori zelula infektatuaren kromosoma batean txertatuko da. Gene normala daramaten zelulak gaixoaren gorputzean, dagokion ehunetan, injektatu. Gaur egun garatzen ari den beste aukera bat: CRISPR-CAS sistema bidez genea aldatzea da.

b) Ingurumenerako Aplikazioak

Ikerketa esparrua: ea genetikoki eraldatutako mikroorganismo batzuek zenbateraino balio duten konposatu kimikoak eraldatzeko, gero hondakin eta isurketa jakin batzuk ezabatzen eta birziklatzen erabiltzeko. Adibidez: Bakterio askok ingurutik metal astunak erauzteko gaitasuna dute (Cu, Pb, Ni...), kobre- edo berun-sulfato bihurtuz ⟹ errazagoa da birziklatzea. Ikerketa esparrua: ea genetikoki eraldatutako mikroorganismoak erabiliz, hidrokarburo kloratuak eta hondakin-uretan egoten diren beste konposatu batzuk degrada daitezkeen. Adibidez: Bakteria batzuek petrolio-isurietako hidrokarburoak degradatzeko gaitasuna dute.

c) Landare Transgenikoak

Gene arrotzen bat zelula guztietan duten landareak dira. 1980an lehenengo barietate transgenikoa: tomate-landarea ⟹ izoztea jasateko arrainen gene bat sartu zuten. Gerora bestelako landare asko: artoa, arroza, garia. Bektore moduan Agrobacterium tumefaciens bakterioa ⟹ landare asko kutsatzeko gai da plasmido bat (plasmido T1) txertatuz: Plasmido-T1ek landare askotan tumoreak (zilak) sortzen dituen gene bat du eta Plasmidoan gene heterologoak (arrotzak) sartu dituzte, bakterioak landareak kutsatzean gene heterologoak sartzeko. Beti ezin da Agrobacterium erabili. Adibidez: gramineoen kasuan (garia, garagarra...) Agrobacterium-ek ez ditu kutsatzen. Kasu hauetan, bestelako bektoreak erabiltzen dira: liposomak edo mikroinjekzioak edo sartu nahi dugun geneaz inguratutako urrezko partikulak (Biobalistika).

Landare transgenikoak lortzeko urratsak

1. Bakterioetatik plasmidoa erauzi + txertatu nahi den DNA ere erauzi.
2. Errestrikzio entzima berberarekin moztu plasmidoa eta txertatuko den DNA.
3. Genea eta plasmidoak elkartu eta DNA ligasa gehitu -> plasmido errekonbinanteak.
4. Plasmidoak A. tumefaciens bakterioen barruan sartu (transformazio bakterianoa).
5. Plasmido errekonbinatua daramaten bakterio koloniak hautatu.
6. Landare zelulak infektatu plasmido errekonbinatua daramaten bakterioekin. Infektatutako landare horietatik abiatuz, zelula guztietan gene heterologoa daramaten transgeniko helduak lortzen dira.

Landare transgenikoak lortzearen helburuak

• Intsektuak hiltzeko toxinak, herbizidekiko, intsektuekiko, gaixotasun mikrobianoekiko erresistentzia edo izoztearekiko erresistentzia.
• Monsanto enpresaren kasua: herbizida + herbizidarekiko erresistenteak diren landare transgenikoak -> monopolioa.
• Nekazaritza-produktuak hobetzeko (fruitu eta barazki gozoagoak edo usain onekoak lortzeko).
• Produktu interesgarriak ekoizteko: Antigorputz monoklonalak edo azukrea.
• Atmosferako nitrogenoa zuzenean asimilatzen duten landareak lortzeko.
• Errendimendu fotosintetikoa handitzeko (C4 landareen geneak transferitu).

Landare transgenikoak: arto transgenikoaren adibidea

Landare transgeniko arrunta: Bt artoa da/Arto honetan, Bacillus thuringiensis bakterioaren gene bat txertatu da. Gene horrek toxina bat kodetzen du/Helburua: Arto-landareetan oso ohikoak izaten dira bi tximeleta espezieren beldarrak arto-landareaz elikatzen direnak landarea barrutik janez/Transgeneak kodetzen duen toxina hilgarria da beldar horientzat, eta toxina hori landarearen zelula guztietan adierazten denez, beldarrak landarea jaten duenean hil egiten da/Toxina horrek ez du inolako efekturik gizakiengan.

GTransgeneen bitartez landareei transferitutako karaktere batzukIntsektuak hiltzeko toxinak, herbizidekiko, intsektuekiko, gaixotasun mikrobianoekiko erresistentzia edo izoztearekiko erresistentzia.*Monsanto enpresaren kasua: herbizida + herbizidarekiko erresistenteak diren landare transgenikoak -> monopolioa/Nekazaritza.produktuak hobetzeko (Fruitu eta barazki gozoagoak edo usain onekoak lortzeko)/Produktu interesgarriak ekoizteko: Antigorputz monoklonalak edo azukrea/Atmosferako nitrogenoa zuzenean asimilatzen duten landareak lortzeko/Errendimendu fotosintetikoa handitzeko. (C4 landareen geneak transferitu)d)ANIMALIA TRANSGENIKOAK Animalia transgenikoa: Berezkoa ez den generen bat zelula guztietan duten animaliak. Gene horiei , gene heterologo edo transgenea deritze/Gene heterologoa zigotoan ⟹zelula guztiak errekonbinanteak/Normalean ugaztunak aldatzen dira ⟹ ugalketa sexuala ere manipulatu, “in vitro” ernalkuntza eginez/Askotan klonazio teknikak ere erabiltzen dira/Gaur egun: arratoi, ardi, txerri, behe, ahuntz eta primate transgenikoak/Transgenea sartzeko birusen edo mikroinjekzioaren bidez egiten daAnimalia transgenikoak sortzearen helburuak  -Ikerkuntzarako animaliak ekoizteko:Giza-genea ezartzen zaio animaliari:Giza-gene jakin batzuen funtzioa ikertzeko eta Garapen enbrionarioa ikertzeko/:Batzuetan gene baten efektua ikertzeko knockout animaliak ekoizten dira (ikertu nahi den genea inaktibatuta duten animaliak)/-Proteinak ekoizteko: Bioerreaktore moduan: intsulina, odoleko proteina koagulatzaileak/-Abeltzaintza hobetzeko: esne, haragi-ekoizpena handitzeko/-Produktu farmazeutikoak ekoizteko:Adib: Pharmig: gizakiaren antitripsina proteina ekoizten duten ardiak. Fibrosi kistikoa duten gaixoetan, ehun-konektiboaren degradazioa ekiditen du proteina horrek.

7. UGAL-MEDIKUNTZA TEKNIKAK a)ERNALKETA eta ZIGOTOAREN LEHEN ZATIKETAK  

b) LAGUNDUTAKO UGALKETARAKO TEKNIKAK Ernaldu gabeko obuluak ateratzen dira obulutegitik eta gorputzetik kanpo elkartzen dira espermatozoideekin -> ernalketa/Ondoren enbrioia emearen ugal-aparatuan ezartzen da/Beste kasu batzuetan, obulu eta espermatozoide nahasketa izaten da emearen ugal-aparatuan ezartzen dena/Teknika desberdinak daude lagundutako ernalketa aurrera eramateko:In vitro ernalketa,Gametoen transferentzia intratubarikoa,Espermatozoideen injekzio intrazitoplasmatikoa/In vitro ernalketaEmakumea hormona bidez tratatzen da, bere obulutegian folikuluen garapena estimulatzeko ⟹ obulu ugari sortzeko/Ondoren, obuluak ateratzen dira (aspirazioz). Obuluak eta espermatozideak hazkuntza-medio batean nahasten dira (in vitro) ⟹ernalketa/Lortutako enbrioiak, blastozisto egoeran daudenean, emakumearen uteroan ezartzen dira (normalean 3 enbrioi ezartzen dira)/Gametoen transferentzia intratubarikoaHartutako obulu eta espermatozoideak zuzenean injektatzen dira emakumearen obiduktuan, bertan gerta dadin ernalketa/Ondoren, blastozistoa, modu naturalean, iritsiko da uteroraino/

Espermatozoideen injekzio intrazito plasmatikoaAntzutasun kasu askotan, arazoa izaten da espermatozideak ezin izaten duela obulua ernaldu/Konpontzeko, espermatozoide bat injektatzen da obulu barruan: beirazko mikropipeta batekin aspirazioz obuluari eusten zaion bitartean, beste mikropipeta meheago batekin espermatozoidea injektatzen da/1992. urtean erabili zen lehen aldiz teknika hau, arrakasta izanik.c)INPLANTATU BAINO LEHENAGOKO DIAGNOSTIKOABatzuetan “in vitro” teknika eta enbrioiaren diagnostikoa uztartzen dira:Gurasoek gaixotasun baten eramaileak direnean ⟶enbrioi egokiak aukeratu eta Pertsona jakin batekiko bateragarria den enbrioia hautatzeko/Bi kasuetan enbrioi hautatua ezartzen zaio emakumeari umetokian/Horrela egiten da:In vitro ernalkuntza egin ondoren, enbrioiek bi edo hiru egunez hazi direnean enbrioi bakoitzetik zelula bat erauzten da/Zelula horri azterketa genetiko bat egiten zaio alterazio kromosomiko edo genikoren baten eramailea den ala ez zehazteko, edo beste pertsona jakin batekin bateragarria den ala ez jakiteko/Enbrioi guztien arterketa genetikoa egin ondoren jakingo dugu zein den umetokian ezartzeko enbrioirik egokiena/Abibide zehatz bat: BETA TALASEMIA HANDIA: MEDITERRANEOKO ANEMIA.11. kromosomaren delezio bat ⟹ ez da sintetizatzen hemoglobinaren beta katea ⟹  Cooley anemia agertzen da/Gene autosomiko eta erresesiboa da ⟹ bi kromosoma homologoetan egon behar da gene mutatua gaixotasuna agertzeko/Eramaileek ondorengoei transmiti diezaiekete ⟹ familiaren ikerketa/Pertsona batek gene mutatua duen ala ez diagnostikatzeko, elektroforesia egiten da.

d)ANIMALIEN KLONAZIOAKlonazioa: genetikoki berdin berdina den beste izaki bat sortzea, morfologikoki eta fisiologikoki ere berdina dena (nahiko erraza da landareetan; animalietan zaila -anfibioetan izan ezik-)/1996an Edimburgoko Roslin Istitutuko Ian Wilmut-ek lehen aldiz ugaztun bat klonatu ⟹ Dolly ardia. Hori egiteko, ardi baten zelula somatikoa erabili zuen eta transferentzia nuklearra deituriko teknika bidez egin zuen/Ordutik hona, beste ugaztun espezie batzuk ere klonatu dira/Animali klonikoak lortzeko, bi teknikak erabili izan dira:/Enbrioi-zelulen disgregazioaBiki unibitelinoak sortzeko naturan gertatzen den teknika bera erabiltzen du (armadilloaren polienbrioniaren antzekoa)/Obulu eta espermatozoidearen ernalkuntza “in vitro”  ⟹ lehenengo zelula totipotentea = zigotoa/Zigotoa mitosiaren bidez zatitu ⟹ enbrioia/Enbrioiaren zelulak bereizten dira (zelula genetikoki berdinak) ⟹ bakoitzetik enbrioi bat sortuko da/Enbrioi bakoitza emearen umetokian inplantatzen da, eta garapen enbrionarioa bukatu eta gero, organismo klonikoak jaioko diraNukleoaren transferentzia Emailea den organismoarengandik zelula heldua lortzen da/Obuluari nukleoa kentzen zaio/Obuluari zelula heldua txertatzen zaio (deskarga elektriko bidez) ⟹Zigotoa ernalkuntzarik gabe/Zigototik ⟹ enbrioia ⟹ eme baten umetokian txertatu ⟹organismo klonikoa/Erabat bereiztutako zelula helduak erabiliz ⟹ animalien klonak: Dolly ardiaren kasua (1997). 2003an Dolly ardia behar baino lehen hil zen, eta ikertzaileek zergatia ez dakiten arren, lehenengo zelula heldua izateagatik izan zela susmatzen dute.

e) KLONAZIO TERAPEUTIKOAZer da? Pertsona baten enbrioi klonikoa lortzea (blastozistoak), enbrioi horretatik ama-zelula enbrionarioak lortzeko/Helburua: ama-zelula horietatik, pertsona horrek zelula diferentziatuak lortzea, bere ehunak erregeneratzeko eta sendatzeko. Zertarako? Gaixotasun degeneratiboak sendatzeko transplanteen errefuxa arazorik gabe/2013an lehen aldiz lortu zuten enbrioiaren zatiketak aurrera egitea (ordurarte 3-4 aldiz zatitu ondoren gelditu egiten zen prozesua), eta enbrioi horretatik erauzitako ama zelula enbrionariotik zelula heldu diferentziatuak lortzea. Hala ere, oraindik asko falta da f)AMA-ZELULAKAma zelulek 3 ezaugarri dituzte: Ez daude difentziatuta edo espezializatuta,Mugarik gabe zatitzeko gai dira. (telomerasa genea adierazten dutelako)eta Zelula diferentziatu mota zehatz bat emateko bidera dakiekeEnbrioi ama-zelulakEspermatozoideak obulua ernaldu =  Zigotoa = diferentziatu gabeko zelula.Zigotoa mitosiz zatituz ⟹enbrioia/Zigotoa zein enbrioiaren lehenengo fasetako zelulak ⟹ totipotenteak ⟹ organismo oso bat garatu daiteke horrelako zelula bakar batetik abiatuz/Ernalkuntza ondoren, bost egunen buruan, enbrioiak esfera itxura du = blastozisto edo blastula:Trofoblastoa: Kanpokaldeko zelula geruza ⟹ hortik garatuko dira enbrioi-mintzak. Zelula-masa: Barnealdeko 30-100 zelulaz osatutako multzoa ⟹ horietatik garatuko da enbrioia ⟹ enbrioi-ama-zelulak dira.

/Barneko zelula horiek pluripotenteak dira (organismoko edozein zelula mota sor ditzakete)/-Enbrioi-ama-zelulak laborategian hazi daitezke (kultibo zelularrak) ⟹ seinale kimiko egokia erabiliz, zelula horiek mota jakin bateko zelulatan diferentzitzea eragin daiteke/-Adib: Arratoiaren enbrioi-ama-zelulak A bitaminaren eratorri batekin tratatuz gero nerbio-zeluletan diferentziatzen dira. Bestelako hazkuntza-faktoreekin tratatuz gero, globulu gorriak eta beste zelula mota batzuk emanez diferentziatzen dira/-Enbrioi-ama-zelulen erabilera terapeutikorako garrantzia: Egunen batean, endekapen zelularrak edota zelulen galerak eragindako gaixotasunak sendatzeko/Adib: Alzheimerra, Parkinsona, hemiplejiak, tetraplejiak, diabetesa, zirrosia, bihotzeko hainbat patologia, leuzemiak, artritisa, erredurak. Gaixotasun guzti horiek sendatu ahal izango lirateke, kaltetutako zelulen ordez, ama-zeluletatik lortutako zelula berriak izanez gero.Ama-zelula helduak Indibiduo helduetan ama-zelulak: multipotenteak ⟶ zelula andui edo mota bakar bat edo gutxi batzuk emanez diferentziatu daitezke/Non? Azalean, burmuinean, hezur-muin gorrian, gibelean, odol-hodietan, muskulu eskeletikoan/Erabilera praktikoa: Helburu terapeutikoarekin erabili izan diren bakarrak, hezur-muin gorrikoak, Hematopoietikoak, odoleko gaixotasunak eta inmunitate-sistemako gaixotasunak tratatzeko/Hainbat saiakera egiten ari dira mesenkimalekin miokardioko infartoak, esklerosi anizkoitza edota artritisa tratatzeko.

Zilbor-hesteko ama-zelulakZilborreko ama-zelulak h multipotenteak dira/Baina ez direnez hain helduak, errefuxa gutxiago eragiten dute eta umeetan erabili izan dira odoleko gaixotasunak eta inmunitate-sistemako gaixotasunak tratatzekoInduzitutako ama-zelula pluripotenteak: IPS zelulak (Induced Pluripotent Stem Cells)Zelula heldu diferentziatuei lau gene txertatuz ama-zelula pluripotente (ama-zelula enbrionarioak bezalakoak) bilakatu daitezke ⟹ IPS zelulak/Lau gene horiek enbrioi zelulen transkripzio faktoreak kodetzen dituzte, eta badirudi zelula helduetan gene horiek txertatuz zelulak “atzera” egiten duela eta enbrioi-ama-zelulak balira bezala jokatzen dutela/IPS zelulak helburu terapeutikoaren erabili ahal izateko, oraindik, lan handia geratzen da: geneak txertatzeko teknika hobetu behar da, adib/Gaur egun birusak erabiliz egiten da.