Aislamiento e Identificación de Enterobacterias: Coprocultivo

Diferenciación Bioquímica

Práctica N° 24

Aislamiento e Identificación de Enterobacterias: Coprocultivo

Introducción

En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de los cuales son patógenos para el hombre y causantes de enfermedades.

El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el coprocultivo, es decir, el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el aislamiento del agente patógeno bacteriano.

La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de alimentos contaminados con heces humanas.

Escherichia coli

Bacilo Gram negativo no esporulado, es miembro de la flora intestinal y en determinadas condiciones patógena para el hombre. Poseen factores de virulencia que les permite causar infecciones en el tracto gastrointestinal así como en el sistema urinario. La E. coli enterotoxigénico (ECET) es la causa común de la "Diarrea del viajero" y produce en el organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la E.coli enterohemorrágica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.

Klebsiella pneumoniae

Bacilos Gram negativos, a veces con cápsula, producen infecciones oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado). El tracto respiratorio y urinario son los lugares de infección más comunes. Es difícil distinguir entre colonización e infección y son productoras de endotoxinas.

Salmonella typhi

Bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos, son exclusivas del hombre y causan la fiebre tifoidea. Otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la Salmonella paratyphi A, B o C.

El género Shigella

Comprende especies que son bacilos Gram negativos inmóviles, causan la Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y fiebre. La especie S. dysenteriae es la más virulenta.

El género Proteus

Presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con flagelos peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital.

Materiales

• Muestra de heces.
• Placas Petri con Agar Mac Conkey.
• Placas Petri con Agar SS.
• Placas con Agar Manitol.
• Tubos con Agar Sabouraud.
• Tubos con medio TSI, LIA.
• Tubos con caldo peptonado.
• Tubos con Citrato de Simmons.
• Tubos con caldo MR-VP.
• Frasco con Lugol.
• Reactivo para Citocromo-oxidasa.
• Reactivo de Kovacks (prueba de indol).
• Reactivo para Rojo de metilo.
• Láminas portaobjeto y cubreobjeto.
• Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%).
• Juego de colorantes para Gram.
• Material básico para laboratorio.

Procedimiento

1. Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de sangre, moco, etc.).
2. Realizar un estudio microscópico de la muestra con Lugol y suero fisiológico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
   • Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml de solución salina.
   • Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey, Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.
   • Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA, Caldo peptonado, Citrato de Simmons y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.

Lectura

• En Agar Mac Conkey, observar las colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
• En Agar SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en las colonias que son SH2.
• En Agar Manitol y Agar Sabouraud, observar el desarrollo de colonias y anotar las características.
• En TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos, el medio toma un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
• En LIA (Agar, Lisina, Hierro), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina, se eleva el pH del medio debido a la producción de aminas, pH= 5.2 (color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador púrpura de bromocresol].
• En Caldo peptonado, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo de Kovac tornándose rojo grosella.
• En Citrato de Simmons, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como fuente de energía y alcaliniza el medio (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color azul), negativo (color verde).
• En Caldo MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando hay producción de ácidos mixtos con un pH ≤ 4.4 (negativo color amarillo).
• En Caldo VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se le añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo (color amarillo).
• Prueba de Citocromo-oxidasa agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima, en caso contrario no habrá ningún cambio de color.
• Coloración de Gram observar los bacilos Gram negativos.
• Con suero fisiológico y Lugol observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos.